嵌合蛋白制造技术

本发明专利技术提供嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白与细胞外配体结合，引起FAS胞内域的活化。所述嵌合蛋白用作自杀基因。本发明专利技术还提供包含此类嵌合蛋白的细胞，例如T细胞，其在过继T细胞免疫治疗方法中有用。

Chimeric protein

The present invention provides chimeric protein, which contains multi spanning transmembrane proteins fused with FAS intracellular domain, wherein the multi spanning transmembrane proteins combine with extracellular ligands, causing the activation of FAS intracellular domain. The chimeric protein is used as a suicide gene. The invention also provides cells containing such chimeric proteins, such as T cells, which are useful in adoptive T cell immunotherapy.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合蛋白专利
本专利技术涉及在过继细胞疗法(ACT)中有用的嵌合蛋白。所述嵌合蛋白可以起自杀基因作用，使得表达所述嵌合蛋白的细胞能够被删除。本专利技术还提供编码此类嵌合蛋白的核酸、包含此类核酸的细胞及其治疗用途。专利技术背景过继免疫疗法是一种已经建立的且不断进化的治疗方法。在同种异体(allogeneic)造血干细胞移植(HSCT)的背景中，频繁地给与供体淋巴细胞输注以治疗造血恶性肿瘤的复发。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)有效治疗转移性黑色素瘤。T细胞的遗传工程大大增加了T细胞疗法的范围和效力：T细胞受体转移允许靶向细胞内癌抗原，而嵌合抗原受体(CAR)允许靶向表面癌症或谱系特异性抗原。已经使用两种方法观察到临床反应，并且正在进行许多进一步的试验。过继性免疫治疗后可能发生急性不良事件。移植物抗宿主病(GVHD)是DLI的常见且严重的并发症。工程化T细胞的施用也导致毒性。例如，在针对黑素瘤抗原的天然T细胞受体转移研究中已经报道了中靶脱肿瘤毒性；重定向至肾细胞癌抗原碳酸酐酶IX(CAIX)的T细胞产生出乎意料的肝毒性。CD19CAR治疗后报告了免疫活化综合征。最后，载体诱导的插入诱变导致淋巴增殖性病症的理论风险。这些毒性的发生率和严重程度是不可预测的。此外，与其中的不良事件通常随着治疗剂的半衰期而减少的治疗性蛋白或小分子形成对比，T细胞植入并且复制，潜在地导致升高和爆发性毒性。自杀基因自杀基因是遗传编码的机制，其允许在面对不可接受的毒性的情况下选择性破坏过继转移的T细胞。已经在临床研究中测试了两种自杀基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。在T细胞中HSV-TK的表达赋予对更昔洛韦(ganciclovir)的易感性。HSV-TK是一种高度有效的自杀基因，但是免疫原性限制了对诸如单倍体相同的(haploidentical)HSCT的深度免疫抑制的临床背景的应用。此外，它妨碍了使用更昔洛韦治疗巨细胞病毒(CMV)感染。iCasp9由实验性小分子化学诱导剂或二聚化剂(CID)激活。该CID是一种实验性药物，并认为是生物学惰性的，因为它不与野生型FKBP12相互作用。然而，使用该试剂的临床经验仅限于非常少数的患者(DiStasi,A.etal.(2011)N.Engl.J.Med.365,1673–1683；和Iuliucci,J.D.etal.(2001)J.Clin.Pharmacol.41,870–879)。它是一种相对大且极性的分子，不太可能穿过血脑屏障。已经描述了基于FAS的CID活化的自杀基因(Amaraetal(1999)Hum.GeneTher.10,2651–2655)。这也依赖于该CID用于激活，并且由于它不直接活化细胞凋亡级联，因此逃避(通过FAS抗性)是可能的。突变型人胸苷酸激酶(mTMPK)使细胞对AZT易感。最近，将HSV-TK，iCasp9与mTMPK进行了比较(Marinetal(2012)Hum.GeneTher.Methods23,376–386)。mTMPK活性不足而不是有用的。已经提出了其他自杀基因，例如全长CD20，其当在T细胞上表达时，能够使得T细胞对通过治疗性抗CD20抗体利妥昔单抗的溶解易感(Introna,M.etal.(2000)Hum.GeneTher.11,611–620)。抗体识别这一主题也描述了其他自杀基因：RQR8使T细胞对CD20敏感，但比全长CD20分子更紧凑(Philip,B.etal.(2014)Blooddoi:10.1182/blood-2014-01-545020)；EGFR的截短形式(huEGFRt)使细胞对通过抗EGFRmAb的溶解易感(Wang,X.etal.(2011)Blood118,1255–1263)；而在细胞表面上表达的myc表位标签使得细胞对使用抗myc抗体的溶解易感(Kiebacketal(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,623–628)。这些抗体依赖性方法的主要限制是它们对高局部浓度下起作用的治疗性抗体的生物利用度的依赖性。已知例如溶解性抗体对于大体积疾病(bulkydisease)不是特别有效，而基于抗体的自杀基因的限制在于驻留于不能达到高抗体浓度处的细胞将会逃脱。因此，需要与上述缺点不相关的替代性自杀基因。附图简述图1：利妥昔单抗(Rituxumab)和奥法木单抗(Ofatumumab)对CD20截短的识别制备了CD20的氨基和羧基末端截短，其中截短了氨基或羧基末端胞内域(endodomain)。将这些与eGFP一起表达并转染到293T细胞中。图2：显示a)RQR8和RQR8-FAS，和b)dCD20-FAS的图图3：比较RQR8和RQR8-FAS和dCD20-FAS的功能显示了在不同测试构建体中当表达并通过奥法木单抗活化时的凋亡(作为表达细胞的百分比)。图4：dCD20-FAS对利妥昔单抗的敏感性和时间进程使用与eGFP共表达的dCD20-FAS转导JurkatT细胞。随时间和以不同浓度的利妥昔单抗时显示了利妥昔单抗诱导的直接杀伤。图5：dCD20-FAS对利妥昔单抗的延伸的剂量-响应曲线在48小时内使用增加稀释的利妥昔单抗培养使用dCD20-FAS转导并共表达eGFP的JurkatT细胞。相对于不同浓度的利妥昔单抗显示了直接杀伤。图6：dCD20-FAS对奥法木单抗的敏感性和时间进程使用与eGFP共表达的dCD20-FAS转导JurkatT细胞。随时间和以不同浓度的奥法木单抗显示了奥法木单抗诱导的直接杀伤。图7：dCD20-FAS对奥法木单抗的延伸的剂量-响应曲线在48小时内使用增加稀释的奥法木单抗培养使用dCD20-FAS转导并共表达eGFP的JurkatT细胞。相对于不同浓度的奥法木单抗显示了直接杀伤。图8：CD20中的P172W突变导致利妥昔单抗抗性。图9：dCD20-FAS和dCD20P172W-FAS对原代人T细胞的直接的和CDC介导的杀伤。图10：通过奥法木单抗的由dCD20-FAS对原代T细胞的直接杀伤的实例。专利技术概述本专利技术人已经开发了新的自杀基因，其可以使用细胞外配体例如抗体诱导，并且具有低的基础毒性和高的诱导毒性。该自杀基因是“三重功能”，因为它可以通过FAS活化，补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)引起自杀。因此，在第一个方面，提供了嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白结合细胞外配体，引起FAS胞内域的活化。多跨跨膜蛋白可以是或包含CD20，或其缺少氨基末端胞内域或羧基末端胞内域的截短形式。细胞外配体可以是抗CD20单克隆抗体，例如利妥昔单抗(Rituxumab)，奥法木单抗(Ofatumumab)或维妥珠单抗(Veltuzumab)。细胞外配体可以包含来自抗CD20单克隆抗体的抗原结合部分(例如VH/VL或互补决定区(CDR)序列)。嵌合蛋白可以包含与缺少氨基末端胞内域的CD20截短形式的羧基末端融合的FAS胞内域。多跨跨膜蛋白可以包含一个或多个突变以增加其结合亲和力或特异性。在多跨跨膜蛋白是或包含CD20或其一部分的情况下，其可以包含一本文档来自技高网...

【技术保护点】
嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白(multi‑spanning transmembrane protein)，其中所述多跨跨膜蛋白与细胞外配体结合，引起所述FAS胞内域的活化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.13 GB 1506223.51.嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白(multi-spanningtransmembraneprotein)，其中所述多跨跨膜蛋白与细胞外配体结合，引起所述FAS胞内域的活化。2.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白是CD20，或其缺乏氨基末端胞内域或羧基末端胞内域的截短形式。3.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中所述细胞外配体是利妥昔单抗(Rituxumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)或维妥珠单抗(Veltuzumab)。4.根据权利要求2的嵌合蛋白，其包含与缺乏氨基末端胞内域的CD20的截短形式的羧基末端融合的FAS胞内域。5.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中参考如SEQIDNo.3所示的全长序列，所述CD20包含突变P172W。6.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中所述CD20包含如SEQIDNo.3、4、5或6所示的序列。7.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白包含异源配体结合域，其结合所述细胞外配体。8.根据前述权利要求中任一项的嵌合蛋白，其中所述FAS胞内域包含如SEQIDNo.20所示的序列。9.核酸序列，其编码根据前述权利要求任一项中的嵌合蛋白。10.核酸构建体，其包含一个或多个根据权利要求9的核酸序列和编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。11.载体，其包含根据权利要求9的核酸序列或根据权利要求10的核酸构建体。12.载体，其包含根据权利要求9的核酸序列，所述载体还包含感兴趣的核苷酸。13.根据权利要求12的载体，其中所述感兴趣的核酸编码嵌合抗原受体或T细胞受体，使得当所述载体用于转导靶细胞时，所述靶细胞共表达根据权利要求1至8中任一项的嵌合蛋白和嵌合抗原受体或T细胞受体。14.细胞，其表达根据权利要求1至8中任一项的嵌合蛋白。15.根据权利要求14的细胞，其是T细胞、自然杀伤(NK)细胞或干细胞。16.制备根据权利要求14或15的细胞的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：M普莱，B菲利普，
申请(专利权)人：UCL商务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB