NKT细胞培养基、培养方法及二者的应用技术

本发明专利技术提供了一种NKT细胞培养基、培养方法及二者的应用，涉及细胞培养技术领域，本发明专利技术提供的一组细胞培养基，包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，每种培养基包括无血清基础培养基和细胞因子。其中，利用无血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种细胞因子能够使NKT细胞受到信号刺激，活化NKT细胞，促进其大量扩增。本发明专利技术提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增高纯度的NKT细胞，对于临床治疗至关重要。

【技术实现步骤摘要】
NKT细胞培养基、培养方法及二者的应用
本专利技术涉及细胞培养
，尤其是涉及一种NKT细胞培养基、培养方法及二者的应用。
技术介绍
自然杀伤性T细胞(naturekillerTcells，NKT细胞)是一群细胞表面既有T细胞受体(TCR)又有NK细胞受体的淋巴细胞亚群。NKT细胞的分布与NK细胞分布相似，也具有组织特异性，在各组织，如肝脏、骨骼、脾脏、淋巴结、外周血、肺脏和胸腺中所占比例各不相同。NKT细胞表面的TCR可以识别由胸腺细胞表面的CD1d分子(非经典MHCⅠ类分子)所提呈的糖脂类抗原，并能够分泌大量细胞因子，参与机体的先天性免疫和适应性免疫。NKT细胞在抗病毒免疫、肿瘤免疫，以及自身免疫疾病中发挥着重要作用。体外实验及肿瘤动物模型的研究显示，CD3+CD56+NKT细胞可通过发挥细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，尤其是在血液性肿瘤中，如非霍奇金氏淋巴瘤、白血病等。CD3+CD56+NKT细胞具有高增殖能力，高细胞杀伤毒性，广泛的肿瘤杀伤作用，对正常骨髓造血影响小的特点，因此，CD3+CD56+NKT细胞治疗被认为是新一代过继免疫治疗的有效方法。目前现有NKT细胞的培养方法主要是使用含有胎牛血清及多种细胞因子混合的培养基扩增培养，或者采用肿瘤细胞与多种细胞因子刺激外周血单个核细胞活化增殖为NKT细胞的方法。现有培养工艺中会添加动物源血清，可能会引入外源性病毒和支原体，存在一定的安全隐患；培养方法使用的肿瘤细胞也会存在一定的安全性问题；且现有方法培养的NKT细胞扩增数量不足，NKT细胞比例低，不能够满足临床治疗的需求。有鉴于此，特提出本专利技术。专利技术内容本专利技术的第一个目的在于提供一组细胞培养基，本专利技术的第二个目的在于提供一种细胞培养方法，本专利技术的第三个目的在于提供上述细胞培养基或细胞培养方法在培养NKT细胞中的应用，以缓解现有技术中存在的NKT细胞扩增数量不足，NKT细胞比例低，纯度不高、技术操作复杂、生产成本高的技术问题。本专利技术提供了一组细胞培养基，所述细胞培养基包括：第一培养基、第二培养基和第三培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；所述第二培养基包括第二基础培养基和第一细胞因子；所述第三培养基包括第二基础培养基和第二细胞因子；其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；所述第一基础培养基包括X-VIVO15；所述第二基础培养基包括AIM-V；所述第一细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-12、白细胞介素-15和白细胞介素-21；所述第二细胞因子为白细胞介素-2和白细胞介素-15。进一步地，在所述第一培养基或第二培养基中，所述白细胞介素-2、白细胞介素-12、白细胞介素-15和白细胞介素-21的终浓度依次为500-1500IU/mL、2-8ng/mL、10-30ng/mL和5-15ng/mL。进一步地，在所述第三培养基中，所述白细胞介素-2和白细胞介素-15的终浓度依次为500-1500IU/mL和10-30ng/mL。进一步地，所述第一培养基和第二培养基还包括自体血浆。本专利技术还提供了一种细胞培养方法，应用上述的细胞培养基进行培养。进一步地，所述细胞培养方法包括：使用第一培养基进行培养，在第一培养阶段每隔一个补液周期补充第二培养基；在第二培养阶段每隔一个补液周期补充第三培养基；进一步地，所述第一培养阶段为接种后0-7天，所述第二培养阶段为接种后8-20天。进一步地，所述补液周期为2-4天。进一步地，所述细胞为外周血单个核细胞。另外，本专利技术还提供了上述的细胞培养基或上述的细胞培养方法在培养NKT细胞中的应用。本专利技术提供的一组细胞培养基，包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，每种培养基包括无血清基础培养基和细胞因子。其中，利用无血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种细胞因子能够使NKT细胞受到信号刺激，活化NKT细胞，促进其大量扩增。本专利技术提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增高纯度的NKT细胞，对于临床治疗至关重要。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的NKT细胞培养的流程图；图2为本专利技术实施例2提供的NKT细胞扩增倍数结果图；图3A为本专利技术实施例3提供的NKT细胞中CD3+NKG2D+细胞占比的流式结果图；图3B为本专利技术实施例3提供的NKT细胞中CD3+CD56+细胞占比的流式结果图；图3C为本专利技术实施例3提供的NKT细胞中CD3+CD16+细胞占比的流式结果图；图3D为本专利技术实施例3提供的NKT细胞中CD4+CD25+细胞占比的流式结果图；图4为本专利技术实施例4提供的NKT细胞杀伤效果结果图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一组细胞培养基，包括：第一培养基、第二培养基和第三培养基；第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；第二培养基包括第二基础培养基和第一细胞因子；第三培养基包括第二基础培养基和第二细胞因子；其中，第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；第一基础培养基包括X-VIVO15；第二基础培养基包括AIM-V；第一细胞因子为白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、白细胞介素-15和(interleukin-15，IL-15)白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)；第二细胞因子为白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)和白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)。在本专利技术中，在第一培养基或第二培养基中，IL-2的终浓度例如可以为，但不限于500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1100IU/mL、1200IU/mL、1300IU/mL、1400IU/mL或1500IU/mL；IL-12的终浓度例如可以为，但不限于2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、或8ng/mL；IL-15的终浓度例如可以为，但不限于10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL或30ng/mL；IL-21的终浓度例如可以为，但不限于5ng/mL、10ng/mL、或15ng/mL。在一个优选的实施方式中，在第一培养基或第二培养基中，IL-2、IL-12、IL-15和IL-21的终浓度依次为1000IU/mL、5ng/mL、20ng/mL和10ng/mL。在本专利技术中，在第三培养基中，IL-2的终浓度例如可以为，但不限于500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1100IU/mL、1200IU/mL、1300IU/mL、1400IU/mL或1500IU/mL；IL-15的终浓度例如可以为，但不限于10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL或30ng/mL。在一个优选的实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基包括：第一培养基、第二培养基和第三培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；所述第二培养基包括第二基础培养基和第一细胞因子；所述第三培养基包括第二基础培养基和第二细胞因子；其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；所述第一基础培养基包括X‑VIVO 15；所述第二基础培养基包括AIM‑V；所述第一细胞因子为白细胞介素‑2、白细胞介素‑12、白细胞介素‑15和白细胞介素‑21；所述第二细胞因子为白细胞介素‑2和白细胞介素‑15。

【技术特征摘要】
1.一组细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基包括：第一培养基、第二培养基和第三培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；所述第二培养基包括第二基础培养基和第一细胞因子；所述第三培养基包括第二基础培养基和第二细胞因子；其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；所述第一基础培养基包括X-VIVO15；所述第二基础培养基包括AIM-V；所述第一细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-12、白细胞介素-15和白细胞介素-21；所述第二细胞因子为白细胞介素-2和白细胞介素-15。2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，在所述第一培养基或第二培养基中，所述白细胞介素-2、白细胞介素-12、白细胞介素-15和白细胞介素-21的终浓度依次为500-1500IU/mL、2-8ng/mL、10-30ng/mL和5-15ng/mL。3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，在所述第三培养基中，所述白细胞介素-2和白...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪琳，金星，王秀娟，
申请(专利权)人：天津长和生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12