自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法技术

本发明专利技术提供了一种自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法，涉及细胞培养技术领域。本发明专利技术自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，应用该细胞培养基质的自然杀伤细胞的扩增培养方法，通过Lymactin‑NK抗体联合上述细胞培养基质中的IL‑2、IL‑12和IL‑15细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，激活自然杀伤细胞并增强细胞杀伤活性。该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，有效缓解了现有自然杀伤细胞培养方法中存在的生产工艺繁琐、生产成本较高以及自然杀伤细胞扩增倍数低，纯度不高难以大规模生产的问题。

The amplification and culture method of natural killer cell culture matrix and natural killer cells

The invention provides a method for amplification and cultivation of natural killer cell culture matrix and natural killer cells, and relates to the field of cell culture technology. The invention of natural killer cell culture matrix by serum-free medium, autologous plasma and cell culture medium components, the application of natural killer cells in the cell culture method, through the Lymactin NK antibody combined with the cell culture medium IL blood mononuclear cells release dangerous signal 2 and IL 12 and IL 15 cytokine induced human peripheral activation of natural killer cells and enhanced cell killing activity. This method can in a short period of high efficient amplification obtained by natural killer cells of high quality, effectively alleviate the existing natural killer cell culture production process in the presence of complex, high production cost and natural killer cell proliferation ratio is low, not high purity to large scale production problems.

【技术实现步骤摘要】
自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其是涉及一种自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(NatureKillercells,NK)是机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，存在于淋巴器官和外周组织中，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能，其无须抗原预先致敏就可以直接识别，并且非特异性地杀伤肿瘤细胞，是人体防御体系的第一道屏障。自然杀伤细胞具有强大的细胞毒活性，它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高；同时，自然杀伤细胞的杀伤活性无需抗原刺激，也不受MHC分子的限制；此外，自然杀伤细胞还具有强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。正因为自然杀伤细胞所具有的上述特点，其在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要作用，被认为是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。但自然杀伤细胞是淋巴细胞中的稀有亚群，在外周血淋巴细胞中约只占10％～20％。正常人体外周血中的自然杀伤细胞含量远不能满足临床治疗的需要。现有自然杀伤细胞的培养方法主要包括以下几种：(1)使用饲养层细胞培养法，如使用病毒转染的B淋巴细胞或肿瘤细胞，以提高自然杀伤细胞扩增倍数。(2)免疫磁珠分选系统阴性分选法，从人源外周血单个核细胞中获得少量自然杀伤细胞后，应用不同细胞因子组合培养，以获得纯度高、扩增效率高、细胞毒性强的自然杀伤细胞。(3)自然杀伤细胞分离试剂盒法，使用商品化试剂盒进行自然杀伤细胞培养。但上述这些培养方法都具有一定程度的缺点，其中，采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作为饲养层细胞以提高自然杀伤细胞扩增倍数的方法，生产工艺繁琐且安全性尚待探讨；采用免疫磁珠分选系统阴性分选法进行自然杀伤细胞培养，生产成本较高；而采用分离试剂盒的方法，因高纯度的自然杀伤细胞在体外扩增效率很低，尚难满足大规模实验以及临床肿瘤免疫治疗的需求。目前大多数自然杀伤细胞培养方法均难以同时满足细胞纯度高、细胞毒性强、扩增倍数高等要求。因此，研究开发一种能够在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞的细胞培养基质和细胞培养方法，进而获得纯度高，细胞毒性强的自然杀伤细胞变得十分的必要与紧迫。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种自然杀伤细胞培养基质，所述培养基质能够大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤细胞。本专利技术的第二目的在于提供一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。本专利技术提供的一种自然杀伤细胞培养基质，所述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子；上述细胞因子包括IL-2、IL-12和IL-15。进一步的，上述无血清培养基由X-VIVO15培养基和AlyS505NK-AC培养基组成，上述X-VIVO15培养基和AlyS505NK-AC培养基的质量比为1：1～2：1。进一步的，上述自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为0～5％。进一步的，上述IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为500～1500IU/mL；IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为2～8ng/mL；IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为10～30ng/mL。更进一步的，IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为1000IU/mL；IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5ng/mL；IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为20ng/mL。本专利技术提供的一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，所述方法包括：使用上述的细胞培养基质在抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞，得到自然杀伤细胞；其中，所述诱导培养的时间为10～20天；所述抗体为Lymactin-NK抗体；优选的，上述Lymactin-NK抗体的浓度为0.3～0.9mg/mL。进一步的，上述诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL。更进一步的，诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.5×106/mL。进一步的，上述诱导培养的过程中还包括对培养基进行补液的步骤；优选的，在诱导培养过程中每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12和IL-15细胞因子；进一步的，所述诱导培养的时间为14天，在诱导培养过程中进行补液的具体步骤为：在诱导培养过程第1～7天，每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12和IL-15细胞因子；在诱导培养过程第8～14天，每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加IL-2和IL-15细胞因子。进一步的，上述补液培养基为无血清培养基AIM-V。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，所述细胞因子包括IL-2、IL-12和IL-15。该培养基质能够大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤细胞，上述IL-2、IL-12、IL-15等细胞因子均可促进NK细胞活化增殖、分泌多种细胞因子和增强其细胞毒作用。同时，本专利技术培养基质使用无血清培养基对自然杀伤细胞进行培养也避免了应用血清培养基进行细胞培养所导致的异源动物血清带来的潜在危险。本专利技术提供的自然杀伤细胞的扩增培养方法，通过Lymactin-NK抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤细胞并增强细胞杀伤活性。该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。有效缓解了现有自然杀伤细胞培养方法中存在的生产工艺繁琐、生产成本较高以及自然杀伤细胞扩增倍数低，纯度不高难以大规模生产的问题。附图说明图1为本专利技术实施例4提供的NK细胞扩增倍数结果图；图2为本专利技术实施例5提供的NK细胞培养流式结果图；图3为本专利技术实施例6提供的NK细胞杀伤效果结果图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。根据本专利技术的一个方面，一种自然杀伤细胞培养基质，所述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子；上述细胞因子包括IL-2、IL-12和IL-15。本专利技术自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，所述细胞因子包括IL-2、IL-12和IL-15。该培养基质能够大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤细胞，上述IL-2、IL-12，IL-15等细胞因子均可促进NK细胞活化增殖、分泌多种细胞因子和增强其细胞毒作用，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自然杀伤细胞培养基质，其特征在于，所述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子；所述细胞因子包括IL‑2、IL‑12和IL‑15。

【技术特征摘要】
1.一种自然杀伤细胞培养基质，其特征在于，所述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子；所述细胞因子包括IL-2、IL-12和IL-15。2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养基质，其特征在于，所述无血清培养基由X-VIVO15培养基和AlyS505NK-AC培养基组成；优选的，所述X-VIVO15培养基和AlyS505NK-AC培养基的质量比为1：2～2：1。3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养基质，其特征在于，所述自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为0～5％。4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养基质，其特征在于，所述IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为500～1500IU/mL；所述IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为2～8ng/mL；所述IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为10～30ng/mL。5.根据权利要求4所述的自然杀伤细胞培养基质，其特征在于，所述IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为1000IU/mL；所述IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5ng/mL；所述IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为20ng/mL。6.一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述方法包括：使用权利要求1～5任一项所述的细胞培养基质在抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞，得到自然杀伤细胞；其...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟春琳，王秀娟，李政楠，
申请(专利权)人：天津长和生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12