长效G‑CSF缀合物的液体制剂制造技术

本发明专利技术涉及长效G‑CSF缀合物的液体制剂。本发明专利技术公开了一种液体制剂，其使得具有改进的体内持续时间和稳定性的长效G‑CSF缀合物能在长时间储存时稳定。所述液体制剂包含以缓冲剂和甘露醇为特征的稳定剂组合物。由于不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，所以所述液体制剂没有病毒感染的问题并且其确保长效G‑CSF缀合物的优异的储存稳定性。

Liquid preparation of long-acting G conjugates of CSF

The present invention relates to liquid formulations of long-acting G CSF conjugates. The invention discloses a liquid formulation, the long-acting G CSF conjugates with improved in vivo duration and stability to be stable in long time storage. The liquid preparation includes a stabilizer composition characterized by a buffer and mannitol. Because it does not contain human serum albumin and other harmful factors, so the liquid formulations without virus infection and its problems to ensure the long-term G CSF conjugates with excellent storage stability.

【技术实现步骤摘要】
长效G-CSF缀合物的液体制剂本申请是申请号为201180006430.9的中国专利申请的分案申请，原申请是2011年1月18日提交的PCT国际申请PCT/KR2011/000369于2012年7月18日进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及用于确保长效G-CSF缀合物的长期储存稳定性的液体制剂，在所述缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段是共价连接的并且显示出相比于野生型延长的作用持续时间。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激骨髓干细胞和白细胞以使其分化和增殖的细胞因子。它是分子量范围为18,000至19,000Da、pI为6.1(5.5-6.1，取决于糖基化程度)的糖蛋白(Nomura等，EMBOJ.5(5)：871-876，1986)。重组DNA技术发现了G-CSF的分子和遗传特性(Clark和Kaman，Science，236：1229-1237，1987)。自从用分离自CHU-2和人膀胱癌5637细胞系的mRNA所构建的cDNA文库克隆人G-CSF基因以来(Nagata等，Nature，319：415-418，1986；Nagata等，EMBOJ.，5(3)：575-581，1986；Souza等，Science，232：61-65，1986)，重组DNA技术就已允许从哺乳动物细胞和原核生物中生产G-CSF。此外，本专利技术人发现修饰的hG-CSF可以以在其N端不含甲硫氨酸残基的形式大量分泌到周质中，其中所述修饰的hG-CSF与野生型的不同之处在于其中至少一个氨基酸残基(特别是17位的半胱氨酸残基)被替换为不同的氨基酸残基(韩国专利No.10-356140)。由于多肽易于因其稳定性低而变性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通过肾脏或肝脏，因此需要频繁地向患者施用蛋白质药物(包括作为药物有效成分的多肽)以维持期望的血液水平浓度和效价。但是，这种蛋白质药物的频繁施用引起患者疼痛，特别是在通过注射施用的情况下。为了解决这些问题，进行了很多努力来改善蛋白质药物的血清稳定性并使血液中的药物在更长的时间内维持在高水平，从而使药物的药效最大化。为了在长效制剂中使用，必须将蛋白质药物配制成高稳定性的且其效价维持在足够高的水平而不引起患者免疫应答。为了稳定蛋白质并防止酶促降解和被肾脏清除，通常使用具有高溶解度的聚合物(如聚乙二醇(PEG))来对蛋白质药物表面进行化学修饰。通过与靶蛋白的特定区域或多个区域结合，PEG使蛋白质稳定并防止水解，而不引起严重的副作用(Sada等，J.FermentationBioengineering71：137-139，1991)。然而，尽管聚乙二醇化能够增强蛋白质稳定性，但其也存在问题，例如大大降低生理活性蛋白质的效价。另外，产量随着PEG分子量的增加而降低，这是由于蛋白质反应性的降低所致。用于改善生理活性蛋白质的体内稳定性的一种替代性方法是通过基因重组技术将生理活性蛋白质的基因与编码具有高血清稳定性之蛋白质的基因连接，并且培养用该重组基因转染的细胞以生产融合蛋白。例如，融合蛋白可以这样制备：通过基因重组将白蛋白(已知的在增强蛋白质稳定性方面最有效的蛋白质)或其片段与目的生理活性蛋白质缀合(PCT公开No.WO93/15199和WO93/15200，欧洲专利公开No.413,622)。另一种方法是使用免疫球蛋白。如美国专利No.5,045,312中所描述的，通过使用交联剂将人生长激素与牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白缀合。该缀合物与未修饰的生长激素相比具有增强的活性。采用碳二亚胺或戊二醛作为交联剂。但是，与肽非特异性结合的这种低分子量交联剂不允许形成均一的缀合物，并且甚至在体内是有毒的。此外，该专利表明活性增加仅仅是由于与生长激素的化学偶联。该专利的方法不能保证不同种类的多肽药物的活性增强，因此该专利甚至没有认识到与蛋白质稳定性相关的因素，如持续时间、血液半衰期等。最近提出的一种药物制剂是体内持续时间和稳定性均改善的长效蛋白质药物制剂。为了在长效药物制剂中使用，通过将生理活性多肽、非多肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接来制备蛋白质缀合物(韩国专利No.10-0567902和10-0725315)。在该方法中，G-CSF可以用作生理活性多肽以提供长效G-CSF缀合物。为了将长效G-CSF缀合物应用到药物产品中，必须维持其在体内的药效，同时抑制在储存和运输期间的物理化学变化，如光、热或添加剂引起的变性、聚集、吸附或水解。与G-CSF多肽自身相比，长效G-CSF缀合物由于其体积和分子量增加因而更难以稳定化。通常，蛋白质具有非常短的半衰期，并且当暴露于不合适的温度、水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂、微生物污染等时，其发生变性，如单体聚集、聚集沉淀以及吸附到容器表面上。在变性后，蛋白质失去其物理化学特性和生理活性。一旦变性，蛋白质几乎不能恢复其原有特性，因为变性是不可逆的。特别在所施用的蛋白质(如G-CSF)是每次注射几百微克的微量的情况下，当它们丧失稳定性并因此吸附到容器表面上时，产生的损失相对较大。此外，在变性过程中吸附的蛋白质容易聚集，并且变性蛋白质的聚集体在施用到体内时，其充当抗原(不像体内合成蛋白质那样)。因此，蛋白质必须以稳定形式施用。已经进行了许多研究以防止蛋白质在溶液中变性(JohnGeigert，J.ParenteralSci.Tech.，43(5)：220-224，1989；DavidWong，Pharm.Tech.，34-48，1997；WeiWang.，Int.J.Pharm.，185：129-188，1999；WillemNorde，Adv.ColloidInterfaceSci.，25：267-340，1986；Michelle等，Int.J.Pharm.120：179-188，1995)。将冻干法应用于一些蛋白质药物以实现稳定性目标。但是，冻干产品的不便之处在于它们必须重新溶解于注射用水中使用。此外，因为其生产过程包括冻干过程，所以需要在大容量冻干机上进行巨大投资。有人提出通过使用喷雾干燥器使蛋白质破碎。但是，该方法由于产量低而不经济。此外，喷雾干燥过程将蛋白质暴露于高温，因此对蛋白质稳定性有负面影响。作为克服该限制的替代方案，出现了稳定剂，当将其添加到蛋白质的溶液中时，可以抑制蛋白质药物的物理化学变化并维持体内药效，甚至在长时间储存之后也是如此。稳定剂有糖类、氨基酸、蛋白质、表面活性剂、聚合物和盐。尤其是人血清白蛋白已被广泛用作多种蛋白质药物的稳定剂并且其性能已得到证明(EdwardTarelli等，Biologicals，26：331-346，1998)。人血清白蛋白的典型纯化过程包括使生物污染物(如支原体、朊病毒、细菌和病毒)失活，或者筛选或检查一种或更多种生物污染物或病原体。但是，总存在因生物污染物未完全去除或失活而使患者处于与其接触的风险。例如，筛选来自供体的人血以检查其是否包含某些病毒。但是，该过程不总是可靠的。特别地，以非常小的数目存在的某些病毒不能被检测到。最近提出了人血清白蛋白的替代物，包括重组白蛋白(韩国专利公开No.10-2004-0111351)和不含白蛋白的G-CSF(韩国专利No.10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长效粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)缀合物的液体制剂，其包含治疗有效量的长效粒细胞集落刺激因子缀合物和不含白蛋白的稳定剂，其中所述缀合物中G‑CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述不含白蛋白的稳定剂包含缓冲剂和甘露醇。

【技术特征摘要】
2010.01.19 KR 10-2010-00048391.一种长效粒细胞集落刺激因子(G-CSF)缀合物的液体制剂，其包含治疗有效量的长效粒细胞集落刺激因子缀合物和不含白蛋白的稳定剂，其中所述缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述不含白蛋白的稳定剂包含缓冲剂和甘露醇。2.根据权利要求1的液体制剂，其中甘露醇的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至20％(w/v)。3.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的浓度范围为5至100mM。4.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为4至8。5.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为5.5至8。6.根据权利要求1的液体制剂，其中所述液体制剂包含治疗有效量的长效粒细胞集落刺激因子缀合物和不合白蛋白的稳定剂，其中所述缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述不含白蛋白的稳定剂包含pH为5.5至8.0的柠檬酸盐缓冲剂、聚山梨酯80和甘露醇。7.根据权利要求1的液体制剂，其中所述不含白蛋白的稳定剂还包含选自等张剂、多元醇、糖、中性氨基酸及其组合的成分。8.根据权利要求7的液体制剂，其中所述等张剂是盐，其选自氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及其组合。9.根据权利要求7的液体制剂，其中所述等张剂的浓度范围为5至200mM。10.根据权利要求7的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)。11.根据权利要求7的液体制剂，其中所述糖选自甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖及其组合。12.根据权利要求7的液体制剂，其中所述糖的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至20％(w/v)。13.根据权利要求7的液体制剂，其中所述多元醇选自丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油、低分子量的聚丙烯及其组合。14.根据权利要求7的液体制剂，其中所述多元醇在所述液体制剂中的浓度范围为1至15％(w/v)。15.根据权利要求7的液体制剂，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李美枝，李才敏，李炳善，裴城敏，权世昌，
申请(专利权)人：韩美科学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR