一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物及其应用，通过FAM、HEX、ROX(修饰)三通道多重PCR反应对CYP2C9和VKORC1基因中的单核苷酸多态性位点进行检测。为了提高检测的简便性和特异性，通过探针分型的技术手段实现一管分型检测，使得整个操作以及反应过程简单化，并在此基础上，对探针进行锁核酸修饰和二级结构修饰，增加探针的Tm值，进一步提高探针结合的特异性的，最后通过调整引物对的配比、Taq酶的用量、镁离子的用量等，提高整个试剂盒的最低检测限、准确性和特异性，试剂盒最低检测浓度能够达到1ng/μl，准确性和特异性均能够达到100％。

A composition for detecting polymorphisms of CYP2C9 and VKORC1 genes and its application

The invention discloses a method for detecting the composition and application of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphism by FAM, HEX, ROX, three (modified) channel multiplex PCR reaction was used to detect the single nucleotide polymorphism of CYP2C9 gene and VKORC1 gene in. In order to improve the detection of the simplicity and specificity of technology through the probe type implementation of tube type detection, which simplify the operation and reaction process, and on this basis, were locked nucleic acid modified and two structural modification of the probe, the probe Tm value increase, and further improve the specificity of probe binding the last, by adjusting the ratio of primer and Taq enzyme dosage, the dosage of magnesium ion, raise the minimum detection limit, accuracy of the whole kit and specific kit for the lowest detectable concentration can reach 1ng/ L, accuracy and specificity were able to reach 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物及其应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的技术。
技术介绍
华法林是一种间接作用的香豆素类口服抗凝药，通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成几种凝血因子而发挥抗凝作用。华法林可以改变血液的粘稠状态，临床上用于预防和治疗血栓。正常剂量的华法林能够抗凝，剂量不足，达不到防止血栓的治疗效果；过量则又容易导致各种出血。患者一旦发生出血，就必须减量或停用华法林，而随后引起的后果就是由于抗凝作用的减弱或停止，导致患者再次形成血栓。由于患者个体间药物代谢能力存在差异，华法林对每个患者的有效剂量是不同的。科学研究显示，个别基因的多态性与华法林体内代谢吸收有密切关系。通过遗传学检测可改善对患者服用华法林剂量的预测准确度，并可用于优化维持剂量，降低引发出血等并发症的风险。华法林是临床常用的预防血栓栓塞性疾病口服药物，但存在明显个体差异。其中，细胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(VKORC1)多态性是华法林个体剂量差异的两个主要影响因素，分别解释约37％和6％的剂量差异。美国食品药品监督管理局(FDA)于2007年8月修改华法林用药标签，提示基因型检测有助于调整华法林给药剂量。2009年美国FDA再次修改华法林用药标签，并根据患者VKORC1和CYP2C9基因型确定华法林起始剂量。国际华法林药物基因组联合会(IWPC)收集了5700例来自4大洲9个国家的21个研究机构使用华法林达到稳定临床疗效的患者信息，并建立数据库。通过对此数据库的筛选和验证，建立了IWPC模型，是目前涉及病例规模最大的模型，该模型可解释华法林个体剂量差异47％。实践证明，依据患者基因型并结合患者临床信息进行华法林个体化给药，可明显提高华法林抗凝达标率，降低抗凝并发症，减少患者再住院率。因此，建议在使用华法林前进行CYP2C9*3和VKORC1基因检测，依据患者基因型指导华法林给药剂量。人CYP2C9基因具有遗传多态性，亚型分为*1、*2和*3，其中与亚洲人群最为密切的是CYP2C9基因的c.1075位核苷酸存在A/C多态性。多态性位点为C(CYP2C9*3型)时，酶活性比野生型降低了80％，而CYP2C9*2型等位基因在中国人中极少发现。研究表明，华法林由CYP2C9代谢，而其突变体使华法林代谢速率大大降低，用药个体在使用初期就有较高的出血危险性。华法林是维生素K环氧化物还原酶VKORC1的特异性抑制剂。大量研究发现，VKORC1启动子的基因多态性(-1639G/A)是影响华法林需求剂量中种族差异和个体差异的最主要因素。因此，CYP2C9和VKORC1基因多态性检测对于华法林用药有重要意义。而目前检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的核苷酸引物及方法准确性和特异性较低，难以在临床广泛应用。所以探索一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性快速可靠的核苷酸引物组及方法已经成为临床实验研究的热点问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物及其应用，通过调整引物的配比、Taq酶的用量和镁离子的用量等，通过FAM、HEX、ROX(修饰)三通道多重PCR反应，并且将引物放置到一管内分型检测，提高检测的简便性和特异性，使得整个操作以及反应过程简单化。并在此基础上，对探针进行锁核酸修饰和二级结构修饰，增加探针的Tm值，进一步提高探针结合的特异性的，最后通过上述体系的调整，使得准确性和特异性均能够达到100％，最低检测浓度能够达到1ng/μL，解决了以往检测CYP2C9和VKORC1基因多态性时准确性和特异性较低的问题。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，包括针对用于检测待检样品中分别与CYP2C9和VKORC1基因相关的特异性目的基因的引物对和探针，包括：CYP2C9*2引物：CYP2C9*2基因正向引物(CYP2C9*2-F):GACGCTGCGGAATTTTG(SEQIDNO.1)；CYP2C9*2基因反向引物(CYP2C9*2-R):GGTTTTTCTCAACTCCTCC(SEQIDNO.2)；探针CYP2C9*2-CFP：FAM-CCTCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGG-BHQ1(SEQIDNO.3)；探针CYP2C9*2-TFP：ROX-TCTTGGAGGACTGTGTTCAAGA-BHQ2(SEQIDNO.4)；CYP2C9*3引物对：CYP2C9*3基因正向引物(CYP2C9*3-F):ACACAGATGCTGTGGT(SEQIDNO.5)；CYP2C9*3基因反向引物(CYP2C9*3-R):TAATGTCACAGGTCACTG(SEQIDNO.6)；探针CYP2C9*3-AF：FAM-AGAAGCAGAGATACATTGACCTTCT-BHQ1(SEQIDNO.7)；探针CYP2C9*3-CFP：ROX-GGAGAGAGATACCTTGACCTTCTCC-BHQ2(SEQIDNO.8)；VKORC1引物对：VKORC1基因正向引物(VKORC1-F)：CTCCTGACCTCAAGTGATCCA(SEQIDNO.9)；VKORC1基因反向引物(VKORC1-R)：CAACAGTAAGGGATCCCTC(SEQIDNO.10)；探针VKORC1-GFP:FAM-CCATTCACCGCACCCGGCCAATGG-BHQ1(SEQIDNO.11)；探针VKORC1-AFP:ROX-AACACGCACCTGGCCAATGGTTGTT-BHQ2(SEQIDNO.12)；内标引物对：HER2-F:TGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCA(SEQIDNO.13)；HER2-R:CCAAACACTGCCTCCAGCTCTTGCC(SEQIDNO.14)；探针HER2-FP:HEX-AGGGCCAGGTCCTGGGGTGGGC-BHQ1(SEQIDNO.15)；其中对CYP2C9*2-CFP、CYP2C9*3-AF和VKORC1-GFP的5，端进行FAM修饰，3，端进行BHQ1修饰；对CYP2C9*2-TFP、CYP2C9*3-CFP和VKORC1-AFP的5，端进行ROX修饰，3，端进行BHQ2修饰；对HER2-FP的5，端进行HEX修饰，3，端进行BHQ1修饰；在CYP2C9*2-CFP序列的第14位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*2-TFP序列的第12位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*3-AF序列的第15位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*3-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在VKORC1-GFP序列的第15位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在VKORC1-AFP序列的第11位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰。优选地，一人份加入量为：CYP2C9*2-F加入量0.1-0.3μL，CYP2C9*3-F加入量0.1-0.3μL，VKORC1-F加入量0.1-0.3μL，CYP2C9*2-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与CYP2C9和VKORC1基因相关的特异性目的基因的引物对和探针，包括：CYP2C9*2引物：CYP2C9*2基因正向引物(CYP2C9*2‑F):SEQ ID NO.1；CYP2C9*2基因反向引物(CYP2C9*2‑R):SEQ ID NO.2；探针CYP2C9*2‑CFP：SEQ ID NO.3；探针CYP2C9*2‑TFP：SEQ ID NO.4；CYP2C9*3引物对：CYP2C9*3基因正向引物(CYP2C9*3‑F):SEQ ID NO.5；CYP2C9*3基因反向引物(CYP2C9*3‑R):SEQ ID NO.6；探针CYP2C9*3‑AF：SEQ ID NO.7；探针CYP2C9*3‑CFP：SEQ ID NO.8；VKORC1引物对：VKORC1基因正向引物(VKORC1‑F)：SEQ ID NO.9；VKORC1基因反向引物(VKORC1‑R)：SEQ ID NO.10；探针VKORC1‑GFP:SEQ ID NO.11；探针VKORC1‑AFP:SEQ ID NO.12；内标引物对：HER2‑F:SEQ ID NO.13；HER2‑R:SEQ ID NO.14；探针HER2‑FP:SEQ ID NO.15；其中对CYP2C9*2‑CFP、CYP2C9*3‑AF和VKORC1‑GFP的5’端进行FAM修饰，3’端进行BHQ1修饰；对CYP2C9*2‑TFP、CYP2C9*3‑CFP和VKORC1‑AFP的5’端进行ROX修饰，3’端进行BHQ2修饰；对HER2‑FP的5’端进行HEX修饰，3’端进行BHQ1修饰；在CYP2C9*2‑CFP序列的第14位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*2‑TFP序列的第12位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*3‑AF序列的第15位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*3‑CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在VKORC1‑GFP序列的第15位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在VKORC1‑AFP序列的第11位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与CYP2C9和VKORC1基因相关的特异性目的基因的引物对和探针，包括：CYP2C9*2引物：CYP2C9*2基因正向引物(CYP2C9*2-F):SEQIDNO.1；CYP2C9*2基因反向引物(CYP2C9*2-R):SEQIDNO.2；探针CYP2C9*2-CFP：SEQIDNO.3；探针CYP2C9*2-TFP：SEQIDNO.4；CYP2C9*3引物对：CYP2C9*3基因正向引物(CYP2C9*3-F):SEQIDNO.5；CYP2C9*3基因反向引物(CYP2C9*3-R):SEQIDNO.6；探针CYP2C9*3-AF：SEQIDNO.7；探针CYP2C9*3-CFP：SEQIDNO.8；VKORC1引物对：VKORC1基因正向引物(VKORC1-F)：SEQIDNO.9；VKORC1基因反向引物(VKORC1-R)：SEQIDNO.10；探针VKORC1-GFP:SEQIDNO.11；探针VKORC1-AFP:SEQIDNO.12；内标引物对：HER2-F:SEQIDNO.13；HER2-R:SEQIDNO.14；探针HER2-FP:SEQIDNO.15；其中对CYP2C9*2-CFP、CYP2C9*3-AF和VKORC1-GFP的5’端进行FAM修饰，3’端进行BHQ1修饰；对CYP2C9*2-TFP、CYP2C9*3-CFP和VKORC1-AFP的5’端进行ROX修饰，3’端进行BHQ2修饰；对HER2-FP的5’端进行HEX修饰，3’端进行BHQ1修饰；在CYP2C9*2-CFP序列的第14位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*2-TFP序列的第12位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*3-AF序列的第15位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；在CYP2C9*3-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在VKORC1-GFP序列的第15位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；在VKORC1-AFP序列的第11位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰。2.根据权利要求1所述的用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，一人份加入量为：CYP2C9*2-F加入量0.1-0.3μL，CYP2C9*3-F加入量0.1-0.3μL，VKORC1-F加入量0.1-0.3μL，C...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沛，王林海，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11