【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物，尤其涉及一种四色荧光光谱校准试剂及其制备方法与应用。
技术介绍
1、毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。基于毛细管电泳可以进行dna片段特定碱基序列的确定，也可以进行dna的相对分析量大小的标记并获得基因型等信息。
2、通过毛细管电泳进行dna片段标记时，单个毛细管同时检测多种荧光标记物发射的荧光信号，由于荧光标记物发射的光谱不是锐线光谱，而是一种有一定宽度的荧光谱带，所以会造成不同荧光光谱之间的信号重叠，通过普通的分光很难将它们区分开。为了校准信号重叠，实现对检测信号的特异性分析，需对所使用的荧光标记物进行光谱校正处理。
3、目前市面上虽然存在八色、五色荧光光谱校准试剂，但是缺少针对rox、tamra、hex和6-fam的四色荧光光谱校准试剂。
技术实现思路
1、本公开提供了一种四色荧光光谱校准试剂及其制备方法与应用，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
2、根据本公开的第一方面，提供了一种四色荧光光谱校准试剂的制备方法，所述四色荧光分别为rox、tamra、hex和6-fam；所述方法包括：
3、分别在荧光引物对1、荧光引物对2、荧光引物对3以及荧光引物对4的正向引物上标记rox、tamra、hex和6-fam；其中荧光引物对1的序列为序列表seq id no.1-2所示；荧光引物对2的序列为序列表seq id no.3-4所示；荧光引物对3的序列为序列表seq id
4、分别将荧光引物对1、荧光引物对2、荧光引物对3以及荧光引物对4与pcr扩增预混合溶液以及对应的模板dna混合进行pcr扩增反应，得到四组扩增产物片段；其中，荧光引物对1、荧光引物对2以及荧光引物对4对应的模板dna序列如序列表seq id no.9所示；荧光引物对3对应的模板dna序列如序列表seq id no.10所示；
5、扩增产物片段经过预处理，得到校准试剂。
6、在一可实施方式中，所述pcr扩增反应的反应体系以25μl计，包括：pcr扩增预混合溶液12.5μl、模板dna 2μl、正向引物1μl、反向引物1μl，其余为水。
7、在一可实施方式中，所述pcr扩增反应的程序为：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火、延伸45s，25个循环；72℃终延伸10min；25℃下保存。
8、在一可实施方式中，所述扩增产物片段经过预处理，得到校准试剂，包括：
9、四组扩增产物片段分别经过胶回收处理，并确定各组回收产物的浓度；
10、四组回收产物按照摩尔比1:1:1:1混合后，得到校准试剂。
11、在一可实施方式中，所述荧光引物对1与对应的模板dna进行pcr扩增反应后，扩增产物片段的长度为75bp。
12、在一可实施方式中，所述荧光引物对2与对应的模板dna进行pcr扩增反应后，扩增产物片段的长度为102bp。
13、在一可实施方式中，所述荧光引物对3与对应的模板dna进行pcr扩增反应后，扩增产物片段的长度为129bp。
14、在一可实施方式中，所述荧光引物对4与对应的模板dna进行pcr扩增反应后，扩增产物片段的长度为141bp。
15、根据本公开的第二方面，提供了一种四色荧光光谱校准试剂，根据上述四色荧光光谱校准试剂的制备方法得到。
16、根据本公开的第三方面，提供了一种四色荧光光谱校准试剂在毛细管电泳荧光光谱校准中的应用。
17、本公开提供一种四色荧光光谱校准试剂的制备方法，用于制备rox、tamra、hex和6-fam四色荧光组合的光谱校准试剂，通过设置特异性的荧光引物对并分别在四组荧光引物对的正向引物上标记rox、tamra、hex和6-fam四种荧光；再将各组荧光引物对与pcr扩增预混合溶液以及对应的模板dna混合进行pcr扩增反应，扩增得到相应大小的扩增产物片段；扩增产物片段经过预处理后，制备成光谱校准试剂。该光谱校准试剂用于毛细管电泳荧光光谱校准中，得到的dna片段检测图谱无重叠峰、校准效果好，从而使得检测结果的判读更加准确。
18、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种四色荧光光谱校准试剂的制备方法，其特征在于，所述四色荧光分别为ROX、TAMRA、HEX和6-FAM；所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应体系以25μL计，包括：PCR扩增预混合溶液12.5μL、模板DNA 2μL、正向引物1μL、反向引物1μL，其余为水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序为：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火、延伸45s，25个循环；72℃终延伸10min；25℃下保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增产物片段经过预处理，得到校准试剂，包括：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光引物对1与对应的模板DNA进行PCR扩增反应后，扩增产物片段的长度为75bp。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光引物对2与对应的模板DNA进行PCR扩增反应后，扩增产物片段的长度为102bp。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光引物对3与对应的模
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光引物对4与对应的模板DNA进行PCR扩增反应后，扩增产物片段的长度为141bp。
9.一种四色荧光光谱校准试剂，其特征在于，根据权利要求1-8任一项所述方法制备。
10.一种根据权利要求1-8任一项所述方法制备的四色荧光光谱校准试剂在毛细管电泳荧光光谱校准中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种四色荧光光谱校准试剂的制备方法，其特征在于，所述四色荧光分别为rox、tamra、hex和6-fam；所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应的反应体系以25μl计，包括：pcr扩增预混合溶液12.5μl、模板dna 2μl、正向引物1μl、反向引物1μl，其余为水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应的程序为：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火、延伸45s，25个循环；72℃终延伸10min；25℃下保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增产物片段经过预处理，得到校准试剂，包括：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光引物对1与对应的...
【专利技术属性】
技术研发人员：于颖，韩达，朱柳，师学江，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。