一种增强测序灵敏度的基因富集方法技术

本发明专利技术公开了一种增强测序灵敏度的基因富集方法，增强测序灵敏度的基因富集方法，包括以下步骤：将DNA突变基因富集预处理的基因引物、基因探针、与DNA基因野生型序列特异性结合的封闭引物Blocker和待测基因样品进行混合，PCR扩增，得到DNA突变基因突变的富集产物；所述DNA基因突变富集预处理的基因引物包括基因正向引物和基因反向引物，封闭引物Blocker为ddC 3’端修饰。解决了常规测序检测灵敏度低的问题，避免了检测成本高、可重复性差、适用范围小和结果准确度低的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种增强测序灵敏度的基因富集方法
本专利技术属于基因检测的
，具体涉及一种增强测序灵敏度的基因富集方法。
技术介绍
目前，肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男女恶性肿瘤死亡人数很高的均为肺癌。肿瘤专家指出，近年来在我国癌症发病的可能呈明显上升趋势，但得到规范治疗的患者却不足一半。例如，肺癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，并且肺癌发病及死亡年龄自40岁以后迅速上升，70岁达到高峰，75岁以后略有下降。女性和男性年龄发病的可能和死亡人数的变化趋势基本一致。但在肺癌死亡人数迅速上升的同时，不同时期的肺癌死亡人数年龄曲线显示，肺癌死亡人数高峰出现前移。也就是说，我国肺癌的发病及死亡年龄有年轻化的趋向。精准医疗将肿瘤基因分型与靶向治疗相结合用于肺癌的治疗，改变了肿瘤临床治疗的格局。EGFR、KRAS、BRAF、MSI等基因是肿瘤靶向治疗或者免疫治疗的重要靶点，其同步检测已被欧洲ESMO、中国诊疗专家达成共识并推荐，是让患者从精准医疗中获益的有效策略。以期最大程度地延长患者生存时间、控制疾病进展程度、提高生活质量。例如，目前非小细胞肺癌的靶向药物有多种，NCCN临床指南也明确要求非小细胞肺癌患者在接受治疗以前要先进行EGFR突变的检测。但是这些基因发生突变在肿瘤细胞中均呈一定的比例，1‰～100％不等。这里所说的肿瘤中基因发生的突变大多为体细胞突变即获得性突变，是在生产发育过程中或者环境因素影响下后天获得的突变，也就是指部分细胞中带有的突变，这一类细胞中基因突变含量一般在1％～100％，甚至低于1％。还有一类突变为胚系突变即生殖细胞突变，来源于精子或卵子这些生殖细胞的突变，因此通常身上所有细胞都带有突变，这一类细胞中基因突变含量一般在50％～100％左右。以下是目前对于基因突变的检测方法有以下几种：Taqman方法：针对特异性突变位置变异设计特异性的探针，探针标记成本较高；采用荧光淬灭及双末端标记技术，有淬灭难以彻底、本底较高的缺陷；采用酶外切活性，定量时受酶性能的影响。DHPLC技术和质谱分析：分别需要用到高效液相色谱仪与质谱仪，设备昂贵，难以在临床诊测中推广。DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，但其依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测，由于不同位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制、可重复性差，易出现假阳性假阴性结果。微测序：作为一种基于阵列的突变分析，目前还面临着如何降低假阴性率和靶核苷酸序列组成的变异等关键问题。限制性酶切方法(RFLP)：准确性较好,费用也较低.但只能对一部分含有现成酶切位点的多态位点进行分型。SNaPshot法：基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，通常用于10-30个SNP位点分析。高分辨率熔解曲线法(HRM)：是近几年兴起的SNP研究工具该方法，无需设计探针，成本低，但结果准确度较低。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。常规的毛细管电泳检测基因突变的灵敏度为15％-20％左右。通常肿瘤组织中基因突变含量为1％-100％之间，少量样本会在1％以下。但是对于液体活检样本例如尿液或者血浆游离DNA，其中基因突变含量很低，一般在1‰-10％之间，因此普通的毛细管电泳方法检测基本无法进行低突变含量样本的检测。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强测序灵敏度的基因富集方法，解决了常规测序检测灵敏度低的问题，避免了检测成本高、可重复性差、适用范围小和结果准确度低的缺陷。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种增强测序灵敏度的基因富集方法，包括以下步骤：将DNA突变基因富集预处理的基因引物、基因探针、与DNA基因野生型序列特异性结合的封闭引物Blocker和待测基因样品进行混合，PCR扩增，得到DNA突变基因突变的富集产物；所述DNA基因突变富集预处理的基因引物包括基因正向引物和基因反向引物，封闭引物Blocker为ddC3’端修饰。进一步地，野生型序列与封闭引物Blocker的结合自由能比突变型序列与封闭引物Blocker的结合自由能高出至少2kcal·mol-1。进一步地，PCR扩增引物对突变型序列的扩增能力比PCR扩增引物对野生型序列的扩增能力高至少70％。优选地，所述DNA突变基因为EGFRT790M基因，所述基因正向引物为EGFRT790M-F：CCTCACCTCCACCGTGC(SEQIDNO.1)；所述基因反向引物为EGFRT790M-R：GGTACTGGGAGCCAATATTGT(SEQIDNO.2)；所述基因探针为EGFRT790M-FP：CCTCCTGGACTATGTCCGGGAAC(SEQIDNO.3)，其中EGFRT790M-FP的5’端进行FAM修饰，3’端进行BHQ1修饰；所述封闭引物Blocker的序列为EGFRT790M-Blocker：CGTGCAGCTCATCACGCAGCTC-ddC(SEQIDNO.4)。优选地，进行一次检测时，EGFRT790M-F(10μM)加入量0.1-1.0μL，EGFRT790M-R(10μM)加入量0.1-1.0μL，EGFRT790M-FP(10μM)加入量0.05-0.5μL，EGFRT790M-Blocker(20μM)加入量0.1-1.0μL。优选地，所述DNA突变基因为KRAS基因，所述基因正向引物为KRAS-F：GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGT(SEQIDNO.5)；所述基因反向引物为KRAS-R：AGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATT(SEQIDNO.6)；所述基因探针为KRAS-FP：GACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA(SEQIDNO.7)，其中KRAS-FP的5’端进行FAM修饰，3’端进行BHQ1修饰；所述封闭引物Blocker的序列包括KRAS-Blocker1：TGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC-ddC(SEQIDNO.8)，KRAS-Blocker2：TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGT-ddC(SEQIDNO.9)，KRAS-Blocker3：ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGA-ddC(SEQIDNO.10)。优选地，进行一次检测时，KRAS-F(10μM)加入量0.1-1.0μL，KRAS-R(10μM)加入量0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强测序灵敏度的基因富集方法，其特征在于，包括以下步骤：将DNA突变基因富集预处理的基因引物、基因探针、与DNA基因野生型序列特异性结合的封闭引物Blocker和待测基因样品进行混合，PCR扩增，得到DNA突变基因突变的富集产物；/n所述DNA基因突变富集预处理的基因引物包括基因正向引物和基因反向引物，封闭引物Blocker为ddC 3’端修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种增强测序灵敏度的基因富集方法，其特征在于，包括以下步骤：将DNA突变基因富集预处理的基因引物、基因探针、与DNA基因野生型序列特异性结合的封闭引物Blocker和待测基因样品进行混合，PCR扩增，得到DNA突变基因突变的富集产物；
所述DNA基因突变富集预处理的基因引物包括基因正向引物和基因反向引物，封闭引物Blocker为ddC3’端修饰。


2.根据权利要求1所述的增强测序灵敏度的基因富集方法，其特征在于，野生型序列与封闭引物Blocker的结合自由能比突变型序列与封闭引物Blocker的结合自由能高出至少2kcal·mol-1。


3.根据权利要求1所述的增强测序灵敏度的基因富集方法，其特征在于，PCR扩增引物对突变型序列的扩增能力比PCR扩增引物对野生型序列的扩增能力高至少70％。


4.根据权利要求1所述的增强测序灵敏度的基因富集方法，其特征在于，所述DNA突变基因为EGFRT790M基因，
所述基因正向引物为EGFRT790M-F：CCTCACCTCCACCGTGC(SEQIDNO.1)；
所述基因反向引物为EGFRT790M-R：GGTACTGGGAGCCAATATTGT(SEQIDNO.2)；
所述基因探针为EGFRT790M-FP：CCTCCTGGACTATGTCCGGGAAC(SEQIDNO.3)，其中EGFRT790M-FP的5’端进行FAM修饰，3’端进行BHQ1修饰；
所述封闭引物Blocker的序列为EGFRT790M-Blocker：CGTGCAGCTCATCACGCAGCTC-ddC(SEQIDNO.4)。


5.根据权利要求4所述的增强测序灵敏度的基因富集方法，其特征在于，进行一次检测时，EGFRT790M-F...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沛，王林海，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11