基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统技术方案

本发明专利技术提供一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统。所述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物为根据维生素D受体基因TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针；基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的试剂、检测方法和系统分别是采用了所述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物的试剂、方法和系统。本发明专利技术提供的所述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物解决了现有技术的TaqI位点多态性检测存在设备昂贵、气溶胶污染、步骤繁琐等技术问题。

【技术实现步骤摘要】
基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统。
技术介绍
维生素D受体基因(vitaminD(1,25-dihydroxyvitaminD3)receptor,VDR),定位于12q13.11，全长63.5kb，有11个外显子，mRNA长4,775nt，编码428个氨基酸残基组成的维生素D受体(VDR)蛋白，是维生素D3的核激素受体，该蛋白也是胆石酸的第二受体。VDR属于转录调控因子，为类固醇激素/甲状腺类激素受体超家族的成员，作为配体诱导性复制因子发挥作用。该蛋白对基因表达的调节主要通过一系列代谢反应通路，包括免疫反应通路和肿瘤激活通路。多项国内外研究证实，VDR基因与钙等金属离子在体内的吸收代谢，从而与骨折、骨质疏松、维生素D依赖性II型佝偻病等疾病有显著相关性。TaqI(rs731236)，与乳腺癌、肺癌、多发性硬化症、II型糖尿病、结核易感性、哮喘、中国汉族重度慢性牙周炎、云南白族人群特发性低枸橼酸尿症等有关。TaqI(rs731236)位于12号染色体的47844974位置上，主要有TT、CT、CC三个基因型。目前常用的针对TaqI(rs731236)多态性检测方法有：1、基于PCR扩增和单碱基延伸后，用MassARRAY或者一代测序仪进行SNP基因型的分型。存在设备昂贵；PCR扩增和单碱基延伸后，均需要一轮酶切消化，步骤繁琐、人力和试剂耗材的投入大；PCR扩增产物需要开盖处理，极易造成室内气溶胶污染，影响结果的准确性等问题。2、利用两个正向引物及一个反向引物，PCR扩增后，经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断目标SNP位点的基因型。存在相同的气溶胶污染的问题；并且在结果判断环节，需要凝胶电泳，而涉及到制胶、点样、跑胶、成像等诸多繁琐的环节，容易出错的同时，人力投入更大；以及结果以图片的形式呈现，判读过程依赖主观因素，容易出错的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的TaqI位点多态性检测存在设备昂贵、气溶胶污染、步骤繁琐等技术问题，本专利技术提供一种解决上述问题的基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物。一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，包括根据维生素D受体基因TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针，序列如下：VDR基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：CGTGCCCACAGATCGTCCTG；VDR基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：GATGTACGTCTGCAGTGTGTTGG；VDR基因TaqI(rs731236)基因型T探针：5’-GCTGATTGAGGCCATCCA-3’；VDR基因TaqI(rs731236)基因型C探针：5’-GCTGATCGAGGCCATCCA-3’。所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。引物和探针以混合液的形式存在，其比例为：(所述正向扩增引物：所述反向扩增引物：所述基因型T探针：所述基因型C探针：水)＝(10:10:4:4:192)。一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的试剂，包括所述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，以及进行Q-PCR反应所需的试剂。一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的检测方法，包括以下步骤：步骤一：提取获得待测样本DNA；步骤二：将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的系统，包括：提取模块，用于提取获得待测样本DNA；检测模块，用于将所述待测样本DNA、述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。相较于现有技术，本专利技术通过采用所述基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，根据维生素D受体基因TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计，上述序列的引物探针组合在有非特异性扩增的情况下，根据AT互换、GC互换的规则，调整引物GC含量为59±2％，且调整后的引物Tm峰值单一。使检测通过一步Q-PCR即可完成，优点在于：1.简单高效：一次Q-PCR反应，操作简单，时长2～3小时；2.可推广性强，所涉及的主设备是实时荧光定量PCR仪，价格相对便宜，大部分机构均可配备；3.结果准确，结果的呈现以数字形式，不受主观判断的影响，客观真实；4.兼容性好，结果可以直接入相应的表格中，进行快速判读，样本处理能力强；5.污染风险小，PCR结束后无需开盖处理，不会产生气溶胶，不会造成假阳性。此外，由于Quencher是淬灭基团，它和荧光基团同时存在于一条DNA链上时，荧光基团不能发出荧光。因此正常情况下，设备不能检测到荧光信号。而在进行Q-PCR反应时，探针特异性地结合到SNP位点，反应液中所包含的DNA聚合酶把探针从目的片段上剪切至反应液中，相应探针上的荧光基因也随之与淬灭基团Quencher分离，被设备所捕获，从而检测出目的SNP的具体基因型。附图说明图1是采用本专利技术提供的基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物进行检测得到的MeltCurve显示图；图2是采用本专利技术提供的基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物进行检测得到的位点多态性分型效果图；图3是图2的表格形式图；图4是采用现有技术进行检测得到的MeltCurve显示图；图5是采用现有技术进行检测得到的位点多态性分型效果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物包括：VDR基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：CGTGCCCACAGATCGTCCTG(对应为序列表中的SEQNo.1)；VDR基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：GATGTACGTCTGCAGTGTGTTGG(对应为序列表中的SEQNo.2)；VDR基因TaqI(rs731236)基因型T探针：5’-GCTGATTGAGGCCATCCA-3’(对应为序列表中的SEQNo.3)；VDR基因TaqI(rs731236)基因型C探针：5’-GCTGATCGAGGCCATCCA-3’(对应为序列表中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，包括根据维生素D受体基因TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针，其特征在于：序列如下：/nVDR基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：/nCGTGCCCACAGATCGTCCTG；/nVDR基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：/nGATGTACGTCTGCAGTGTGTTGG；/nVDR基因TaqI(rs731236)基因型T探针：/n5’-GCTGATTGAGGCCATCCA-3’；/nVDR基因TaqI(rs731236)基因型C探针：/n5’-GCTGATCGAGGCCATCCA-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，包括根据维生素D受体基因TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针，其特征在于：序列如下：
VDR基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：
CGTGCCCACAGATCGTCCTG；
VDR基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：
GATGTACGTCTGCAGTGTGTTGG；
VDR基因TaqI(rs731236)基因型T探针：
5’-GCTGATTGAGGCCATCCA-3’；
VDR基因TaqI(rs731236)基因型C探针：
5’-GCTGATCGAGGCCATCCA-3’。


2.根据权利要求1所述的基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，其特征在于：所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。


3.根据权利要求1所述的基于探针法实现维D受体TaqI位点准确分型的引物组合物，其特征在于：所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。


4.根据权利要求1至3任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：代冰，周梅华，余艳，龚强，陈鹏，李慧源，何媛，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43