一种RNA分子m6A修饰水平检测方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种检测生物或医学样品中RNA m6A修饰水平的方法。该方法的特征在于其是基于利用YTHDF2蛋白结合RNA分子m6A的特性，以干扰反转录酶对RNA分子的反转录反应，进而通过PCR扩增技术检测特定位点m6A修饰的特定RNA分子。本方法可以用于生物或医学样品中m6A修饰的RNA分子的检测分析。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA分子m6A修饰水平检测方法及用途
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种m6A修饰RNA分子的检测方法，本方法可用于m6A修饰的RNA分子检测分析以及生物和临床标本的检测。
技术介绍
RNA碱基修饰在RNA分子中普遍存在。近年研究表明RNA分子中不同的碱基修饰具有重要的生物学功能，RNA分子中碱基的动态修饰变化与多种疾病发生发展有关(BatistaPJ.TheRNAModificationN(6)-methyladenosineandItsImplicationsinHumanDisease.GenomicsProteomicsBioinformatics.2017，15(3)：154-163)。因此，对RNA分子的碱基修饰研究越来越受到关注。目前研究最多且研究较为清楚的是RNA分子的m6A修饰。但是，目前针对RNA分子m6A修饰的分析方法主要是通过基于m6A抗体的RNA甲基化(m6A)免疫共沉淀高通量测序(meRIP-seq)方法获得数据，再采用生物信息学方法进行分析获得RNA分子的m6A修饰的信息(DominissiniD，etal.Topologyofthehumanandmousem6ARNAmethylomesrevealedbym6A-seq.Nature.2012，485(7397)：201-206；ChenK，etal.High-resolutionN6-methyladenosine(m6A)mapusingphoto-crosslinking-assistedm(6)Asequencing.AngewChemIntEdEngl.2015，54(5)：1587-1590)。基于上述方法虽然衍生了一系列不同的方法，但是这类方法更适合于对RNA分子的总体修饰状况进行分析。目前针对特定位点修饰的RNA分子检测分析方法还在发展中。Golovina等建立了溶解曲线变化检测方法(GolovinaAY，etal.Methodforsite-specificdetectionofm6AnucleosidepresenceinRNAbasedonhigh-resolutionmelting(HRM)analysis.NucleicAcidsRes.2014，42(4)：e27)，Hong等建立了基于4SedTTP和FTO(fatmassandobesityassociatedprotein)参与的干扰反转录检测方法(HongT，etal.PreciseAntibody-Independentm6AIdentificationvia4SedTTPInvolvedandFTO-AssistedStrategyatSingle-NucleotideResolution.JAmChemSoc，2018，140：5886-5889)。这些方法可以检测特定位点的m6A修饰的RNA。这些方法有其特点，但是也都存在着不足。检测分析特定RNA分子特定位点的m6A修饰水平的变化对于m6A修饰RNA的生物功能研究，以及对于检测分析疾病相关临床样本中特定RNA分子中特定位点m6A修饰发现疾病诊断和治疗标志物分子都具有十分重要的意义。由于m6A与A相似度高，并且在绝大多数情况下RNA分子中的m6A修饰所占比例低，这就使得常规检测分析方法不能够简便、快速、大规模地监测分析特定位点m6A修饰的特定RNA分子。近来研究已经发现有多种蛋白分子参与RNA分子的m6A修饰，包括修饰酶、去除酶和相关结合蛋白分子。其中YTHDF2(YTHdomain-containingfamilyprotein2)具有天然特异性结合m6A的功能(ZhuT，etal.CrystalstructureoftheYTHdomainofYTHDF2revealsmechanismforrecognitionofN6-methyladenosine.CellRes.2014，24(12)：1493-1496；LiF，etal.StructureoftheYTHdomainofhumanYTHDF2incomplexwithanm(6)Amononucleotiderevealsanaromaticcageform(6)Arecognition.CellRes.2014，24(12)：1490-1492)。YTHDF2结合m6A的特点为建立检测m6A修饰RNA分子方法提供了条件。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种检测m6A修饰RNA分子的简便方法，实现对特定位点m6A修饰的RNA分子的检测，适用于生物样本和临床样本的检测分析。本专利技术的检测方法，其特征在于利用YTHDF2蛋白结合RNA分子中m6A甲基化修饰位点的特性，在进行RNA的反转录反应体系中加入YTHDF2蛋白，YTHDF2蛋白分子结合RNA中具有m6A修饰的位点，进而阻碍RNA反转录反应反转录引物的延伸，获得终止于m6A修饰位点前的cDNA短片段反转录产物。通过设计一对跨m6A修饰位点的PCR反应引物，以及一对RNA分子m6A修饰位点3’侧的PCR扩增引物，用两对引物对反转录产物分别进行扩增，通过比较扩增结果，实现对m6A修饰RNA分子进行检测分析。m6A修饰RNA分子检测方法包括两个主要步骤：(1)反转录反应。一组正常反转录反应，一组加入YTHDF2蛋白与RNA分子结合的反转录反应。(2)PCR反应。分别使用跨m6A修饰位点的PCR反应引物，以及RNA分子m6A修饰位点3′侧的PCR扩增引物，进行PCR反应。依据PCR反应检测扩增产物方式的不同，可以采用普通PCR反应，也可以加入荧光染料或分子信标采用实时定量PCR反应。依据检测RNA分子目的不同，也可以仅使用加入YTHDF2蛋白与RNA分子结合的反转录反应产物进行PCR检测。在本专利技术的方法中，使用的YTHDF2蛋白可以是分离纯化于人细胞系和组织，也可以是在原核和真核表达系统表达的融合蛋白。本实施例中使用的是分离纯化于在大肠杆菌中表达的带有His标签的重组人YTHDF2蛋白。再具体的反应中，YTHDF2的蛋白使用量依据反转录反应中使用RNA量，以及RNA中m6A修饰程度而定，已达到满足检测要求的阻断效果。在通常使用的反转录体系中，YTHDF2蛋白的用量可以是几个微克至几百微克。在反转录反应中，反转录酶的用量和dNTP的量对反转录反应效率是有影响的。通常情况下，在一定的范围内，反转录酶使用量的增加，dNTP浓度的增高，有利于反转录反应的进行。本专利技术的方法是利用YTHDF2结合RNA分子中m6A修饰位点的特性来阻断反转录反应的进行。为了达到检测要求的阻断效果，反转录酶的用量可以是通常使用的反转录试剂盒推荐用量，也可以减少至其推荐用量的八分之一或更少。dNTP的浓度可以是通常使用反转录试剂盒推荐用量，也可以减少至1微摩尔/升以下。同样是依据反转录反应中RNA的用量，以及RNA分子的m6A修饰程度而定，已达到满足检测要求的阻断效果。本专利技术提供的RNAm6A甲基化检测的方法，其包括测定样品中一种或多种RNA。在实际检测过程中，可以检测其中任一种RNA分子，也可以检测不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种m6A修饰RNA分子检测法，其特征在于：基于纯化的细胞、组织和体液中的总RNA，在其反转录反应中加入m6A结合蛋白YTHDF2，使其结合RNA分子中的m6A，以干扰反转录反应的进行，获得终止于m6A修饰位点前的cDNA片段，利用一对跨m6A修饰位点引物和一对m6A修饰位点一侧的引物分别对反转录获得的cDNA进行PCR反应，通过比较上述两组PCR反应的Ct值以达到检测m6A修饰RNA的目的。/n

【技术特征摘要】
1.一种m6A修饰RNA分子检测法，其特征在于：基于纯化的细胞、组织和体液中的总RNA，在其反转录反应中加入m6A结合蛋白YTHDF2，使其结合RNA分子中的m6A，以干扰反转录反应的进行，获得终止于m6A修饰位点前的cDNA片段，利用一对跨m6A修饰位点引物和一对m6A修饰位点一侧的引物分别对反转录获得的cDNA进行PCR反应，通过比较上述两组PCR反应的Ct值以达到检测m6A修饰RNA的目的。


2.根据权利要求1中所述的检测方法，其特征在于：包括两个主要步骤，(1)反转录反应；(2)PCR反应。


3.根据权利要求1中所述的反转录反应中所用的m6A结合蛋白YTHDF2，其特征在于：YTHDF2蛋白为纯化的YTHDF2蛋白，或为重组表达的YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白，YTHDF2蛋白在反应中的用量为1微克至100微克。
<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓飞，付汉江，苏晨，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11