一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变的方法。该方法利用多重PCR‑质谱法检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变。本发明专利技术的检测方法，包括以下步骤：1)针对不同耐药位点的引物设计；2)多重PCR扩增反应；3)虾碱性磷酸酶处理；4)单碱基延伸反应；5)树脂脱盐纯化；6)质谱检测。

【技术实现步骤摘要】
一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法
本专利技术属于分子生物学检测
，涉及一种多重耐药位点的检测方法，特别涉及一种多重PCR-质谱检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法。
技术介绍
淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)是一种严重影响公共卫生的性传播病原体，全球新发感染率高达8700万例。高发病率不但加重了全球健康经济成本，更导致了严重耐药问题。伴随着淋球菌的耐药性发展和蔓延迅速，过去广泛推荐使用的抗生素(磺胺类药物、青霉素、早期头孢菌素、四环素、大环内酯和喹诺酮类药物)相继退出淋病推荐一线推荐用药。目前世界卫生组织推荐的一线经验性用药为头孢菌素联合阿奇霉素，而广谱头孢菌素类(Extended-spectrumcephalosporins，ESCs)在多个国家被认为是目前用于淋球菌感染单抗生素治疗的最后一种选择。不幸的是，近年来不断有多地报告了头孢菌素和奇耐霉素双耐药株，最近更是在英国和澳大利亚发现了超级耐药株，在阿奇霉素高耐的同时也对头孢菌素耐药，不断增长的耐药性可能会导致淋病进入一个无法治疗的时代。淋球菌感染的治疗面临着耐药现状严重，而细菌还在不断获得新的耐药机制的困境。我们必须对其耐药性及时检测和监控，建立合适的治疗方案才能使我们对淋病的控制更加强有力。常规的淋球菌耐药性检的测方法分为培养法和非培养法，培养法测淋球菌MIC(最低抑菌浓度)是淋球菌耐药性诊断的“金标准”，特异性强，准确性高，也是唯一可以获得纯培养的分离株的方法。但这种方法需要经历繁琐费时的培养过程，缺乏时效性，且不适用于大量样本的情况。核酸扩增方法(Nucleicacidamplificationtests，NAATs)具有耗时短，自动化等优点，通过检测特定耐药相关突变位点，可实现快速检测淋球菌耐药性。但是此类方法均受到方法通量的限制，且检测位点有限，无法运用于大规模样本的耐药相关位点的监测和获得全面的耐药信息。目前WGS(WholeGenomeSequencing)也成功的运用到淋球菌耐药检测中，可及时发现新的耐药相关基因以及突变，且对耐药突变位点的预测具有指导意义。但成本与技术限制了WGS在一些资源有限的地区的广泛运用，同样不适用于大规模样本的监测。因此有必要开发一种具有高通量，低成本和全面检测淋球菌耐药相关位点的多重检测方法，以进行有效的筛选。在临床治疗中，可通过一次快速的检测获得全面的耐药信息，从而选择最佳治疗方案。在而公共卫生层面，该方法一个工作人员可在8h内同时检测大量份样本，适用于大规模的淋球菌耐药监测，可及时监测不同地区不同人群中的耐药分布情况。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测淋球菌耐药相关位点突变的方法，该方法用于非诊断目的。该方法利用多重PCR-质谱法检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变。本专利技术所提供的用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，是选取与五类抗生素(头孢菌素类、大环内酯类、喹诺酮类、大观霉素、青霉素类)耐药相关基因作为检测的靶基因，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16SrRNA和23SrRNA。本专利技术所述的19个淋病奈瑟菌耐药位点突变，包括：1)16SrRNAC1192U2)rpsET24P3)23SrRNAC2611T4)23SrRNAA2059G5)gyrAD95G/A6)gyrAS91F7)parCD86N8)parCS88P9)penAG542S10)penAG545S11)penAA501T/V12)penAP551S/L13)penAA311V14)penAD345-insertion15)ponAL421P16)mtrR-G45D17)mtrR-deletionA18)porB-A121DN(G)19)porBG120D(KNR)本专利技术所述的19个检测靶点，其作用如下：1)16SrRNAC1192U和rpsET24P用于检测大观霉素耐药性；2)23SrRNAC2611T和23SrRNAA2059G用于检测大环内酯类抗生素耐药性；3)gyrAD95G/A、gyrAS91F、parCD86N和parCS88P用于检测喹诺酮类抗生素耐药性；4)penAG542S、penAG545S、penAA501T/V、penAP551S/L和penAA311V用于检测头孢菌素耐药性；5)penAD345-insertion、ponAL421P用于检测青霉素类抗生素耐药性；6)mtrR-G45D和mtrR-deletionA两靶标用以确定外排泵MtrCDE的表达情况，与多种抗生素耐药性相关；7)靶标porB-A121DN(G)和porBG120D(KNR)用于确定主要外膜蛋白表达情况，与多种抗生素耐药性相关；8)penA-D345del和penA-G545S用于识别淋病奈瑟菌的mosaicpenA型别；9)penAA311V用于识别包含A311V突变的mosaicpenA型别；10)opa和porA两靶标作为淋病奈瑟菌种属的鉴定和确认；本专利技术所述的检测方法，包括以下步骤：1)引物设计：针对每一种拟检测耐药位点，首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16SrRNA和23SrRNA，将参考序列提交到NCBI的进行核酸序列BLAST，选择nr数据库，下载比对得到的结果，得到19个检测淋病奈瑟菌耐药位点突变所在的靶基因序列，针对每个靶基因中的待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；2)多重PCR扩增反应：将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中混匀，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，预变性，随后作PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；3)虾碱性磷酸酶反应：多重PCR反应结束后，加入SAP混合液，使用SAP消化去除反应体系剩余的dNTP，预防多余的底物影响下一步单碱基延伸反应结果；4)单碱基延伸反应：加入针对耐药位点设计的延伸探针，结合至扩增出来的靶基因进行单碱基延伸反应，底物为经过修饰的双脱氧三磷酸核苷，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，通过分子量差异可判断延伸碱基，作分子量标记，以判断耐药位点基因型；5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：/n1)引物设计：针对每一种拟检测耐药位点，首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA，将参考序列提交到NCBI的进行核酸序列BLAST，选择nr数据库，下载比对得到的结果，得到19个检测淋病奈瑟菌耐药位点突变所在的靶基因序列，针对每个靶基因中的待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；/n2)多重PCR扩增反应：将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中混匀，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，预变性，随后作PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；/n3)虾碱性磷酸酶反应：多重PCR反应结束后，加入SAP混合液，使用SAP消化去除反应体系剩余的dNTP，预防多余的底物影响下一步单碱基延伸反应结果；/n4)单碱基延伸反应：加入针对耐药位点设计的延伸探针，结合至扩增出来的靶基因进行单碱基延伸反应，底物为经过修饰的双脱氧三磷酸核苷，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，通过分子量差异可判断延伸碱基，作分子量标记，以判断耐药位点基因型；/n5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；/n6)质谱检测：纯化后产物采用全自动点样装置点到芯片，进行分子量检测，根据分子量差异确定待测靶基因上耐药位点的基因型。/n...

【技术特征摘要】
1.一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：
1)引物设计：针对每一种拟检测耐药位点，首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16SrRNA和23SrRNA，将参考序列提交到NCBI的进行核酸序列BLAST，选择nr数据库，下载比对得到的结果，得到19个检测淋病奈瑟菌耐药位点突变所在的靶基因序列，针对每个靶基因中的待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；
2)多重PCR扩增反应：将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中混匀，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，预变性，随后作PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；
3)虾碱性磷酸酶反应：多重PCR反应结束后，加入SAP混合液，使用SAP消化去除反应体系剩余的dNTP，预防多余的底物影响下一步单碱基延伸反应结果；
4)单碱基延伸反应：加入针对耐药位点设计的延伸探针，结合至扩增出来的靶基因进行单碱基延伸反应，底物为经过修饰的双脱氧三磷酸核苷，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，通过分子量差异可判断延伸碱基，作分子量标记，以判断耐药位点基因型；
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；
6)质谱检测：纯化后产物采用全自动点样装置点到芯片，进行分子量检测，根据分子量差异确定待测靶基因上耐药位点的基因型。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)引物设计中，19个淋病奈瑟菌耐药位点突变，包括：
1)16SrRNAC1192U
2)rpsET24P
3)23SrRNAC2611T
4)23SrRNAA2059G
5)gyrAD95G/A
6)gyrAS91F
7)parCD86N
8)parCS88P
9)penAG542S
10)penAG545S
11)penAA501T/V
12)penAP551S/L
13)penAA311V
14)penAD345-insertion
15)ponAL421P
16)mtrR-G45D
17)mtrR-deletionA
18)porB-A121DN(G)
19)porBG120D(KNR)。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对待检测耐药位点分别设计一对扩增引物和一条延伸探针，扩增引物和延伸探针序列为SEQIDNO.1至SEQIDNO.62。


4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，添加人类的opa基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQIDNO.63和SEQIDNO.64，延伸探针序列为SEQIDNO.65。


5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，添加人类的porA基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQIDNO.66和SEQIDNO.67，延伸探针序列为SEQIDNO.68。


6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中，在步骤(2)-步骤(4)的反应中加入阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶蒸馏水；
其中，步骤(2)PCR反应体系见表2-1，反应流程见2-2；
其中，步骤(3)虾碱性磷酸酶反应体系见表3-1，反应流程见3-2；
其中，步骤(4)碱基延伸反应体系见表4-1，反应流程见4-2；
其中，步骤(6)质谱检测：产物纯化后使用专用设备转移到芯片上，与芯片基质进行共结晶，结晶后的芯片放入质谱仪的真空管内，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统真空管中受到瞬时的强激光激发，使核酸分子解吸附并产生单电荷离子，这些离子在真空小管中飞行达到检测器，离子质量大小与飞行时间成正比，可检测分子质量数取决于飞行管长度，检测结...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭俊平，郭军华，李雅梅，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11