EGFR基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种EGFR基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法。该组合物包括突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物，所述突变型检测用组合物包括上游引物F1、上游引物F1‑1、水解探针P1和下游引物；所述野生型检测用组合物包括上游引物F2、上游引物F2‑1、水解探针P2和下游引物；其中上游引物F1和F2均是由不匹配区和匹配区组成，上游引物F1和F2的匹配区分别特异性结合待检测序列区域。上游引物F1和F2的不匹配区上均有相对应检测用上游引物和水解探针的相同序列。与现有技术相比，本发明专利技术具有显著提高的灵敏度和高度特异性，并且大幅降低了引物和测试成本，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
EGFR基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物医学核酸检测
，具体涉及EGFR基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的金标准和临床治疗的基础。然而对组织学类型、分期相同的肿瘤患者采取相同的治疗方案，往往只有一部分肿瘤患者有反应。据统计，传统医疗在肿瘤治疗上用药无效率高达75％。恶性肿瘤的疗效不好在于难以从组织诊断水平上对其恶性特征和药效特征进行判断。研究表明，肿瘤病变的分子特征决定了其恶性特征，转移特征，复发特征和耐药特征，是肿瘤愈后判断和对化疗药物反映的基本依据。因此，基于分子差异的个体化治疗是肿瘤精准治疗的方向，分子分型是实现个体化精准治疗的基础。表皮生长因子受体EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。该EGFR基因位于7号染色体短臂7p12-14区，由28个外显子组成。EGFR基因的突变种类繁多，主要发生在18～21号外显子之间的酪氨酸激酶活性位点处。其最常见的敏感突变为19外显子缺失突变(约占45％)和21号外显子的L858R点突变(约占40％)，二者均可导致酪氨酸激酶结构域活化。目前，19外显子的缺失突变种类可高达30～40种，超过50％的缺失突变中伴随着插入突变。COSMIC数据库统计显示，最常见的19号外显子突变亚型为delE746-A750(68.9％)，其次为delL747-P753insS(6.0％)，delL747-T751(4.1％)。拥有19外显子突变的非小细胞肺癌(Nonsmallcelllungcancer,NSCLC)患者，接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物(EGFR-TKIs)治疗后，可显著延长患者的无进展生存期(ProgressionFreeSurvival,PFS)和提高药物反应率，不同亚型的患者之间无显著性差异。因此，对NSCLC患者进行EGFR突变状态的检测已成为其临床治疗方案确定的依据。通过检测患者外周血中的循环肿瘤DNA(ctDNA)可以实现对肿瘤患者的早期筛查、用药指导、预后判断以及复发监测。但由于外周血样本背景复杂，ctDNA含量稀少，对于低丰度以及稀有序列的检测，荧光定量PCR法、分子杂交法、毛细管电泳以及二代测序均容易受到背景DNA的干扰，使得检测灵敏度及精确度都达不到精确定量的要求。数字PCR(digitalPCR,dPCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术，其利用极限稀释的原理将一个荧光定量PCR反应体系分配到成千上万份单独的纳升级微反应器中，使得每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子(DNA靶标)，再同时进行单分子模板PCR扩增。不同于荧光定量PCR在每个扩增循环进行时采集荧光的方法，数字PCR在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行独立采集，最后通过泊松分布的原理及阳性/阴性的反应单元的比例得出目标分子的原始拷贝数或浓度。相较于荧光定量PCR，数字PCR不依靠Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，具有灵敏度高以及精确度高的优势。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断“有/无“两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，所以数字PCR反应和结果判读受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高。此外，数字PCR实验中对反应体系进行分配的过程可以极大程度上在局部降低与靶标序列有竞争作用的背景序列浓度，因此，数字PCR特别适合在复杂背景中检测稀有突变，目前多应用在液体活检中，实现在肿瘤患者外周血中检测稀有突变标志物。而目前现有的基因缺失突变检测试剂，多采用TaqMan探针法、引物特异性区分法或阻断野生型扩增法。其中TaqMan探针的基本原理是利用扩增过程中Taq酶的5’核酸外切酶活性切割与靶核酸序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针延伸，当引物延伸至寡核苷酸探针结合位置时，Taq酶可以将其切割成小片段，使得荧光报告基团与淬灭基团分开，从而发出荧光。将其运用在肿瘤基因缺失突变检测中，通常会采用分别针对突变型和野生型的竞争性探针。由于EGFR19外显子缺失突变类型众多，针对不同的突变类型需设计多种不同的突变型探针，费用较高，不利于大规模的推广使用。另一种较常用的TaqMan探针法为在EGFR19外显子常见缺失区域设计一条针对野生型的探针，在其它保守区域设计一条可以同时指示野生型和突变型模板的通用探针，两条探针共用上下游引物。一方面，由于ctDNA呈高度随机的片段化分布，该方法需要较长的待测靶核酸序列，因此，较短的DNA片段可能会被漏检，降低检测灵敏度；另一方面，将该方法应用在数字PCR时，由于数字PCR需对核酸扩增体系进行分区处置，当一个微反应室内同时含有突变型和野生型模板时，突变型荧光信号可能被淹没，从而导致突变丰度定量偏低。引物特异性区分法是在常见缺失区域设计针对突变型的一条或多条特异性引物，在特异性引物下游的保守区域设计一条水解探针及下游引物，在EGFR基因的其它外显子的保守区域设计一条可以同时指示野生型和突变型模板的通用探针及其上下游引物。但是将该方法应用于数字PCR时，又存在野生型荧光信号被淹没的可能性，从而导致突变丰度定量偏高。阻断野生型扩增法常采用肽核酸(PeptideNucleicAcid，PNA)，锁核酸(LockedNucleicAcid,LNA)修饰来阻断野生型模板的扩增，一方面，将该方法应用于数字PCR时，也存在野生型荧光信号被淹没的可能性，另一方面，这些修饰价格高昂，不利于临床应用。在数字PCR技术的应用中，由于其不依靠Ct值和标准曲线，仅通过终点荧光信号强度进行结果判读，无法通过ΔCt来区分突变型与野生型，所以对引物探针的特异性要求极高，应尽可能的避免交叉反应。因此需要一种灵敏度高，特异性好，成本低的引物探针设计方法来满足临床使用数字PCR技术检测的需要。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种人类EGFR基因突变数字PCR检测用组合物及其方法。一种EGFR基因缺失突变检测用组合物，该组合物包括突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物；所述突变型检测用组合物包括上游引物F1、上游引物F1-1、水解探针P1和下游引物；所述野生型检测用组合物包括上游引物F2、上游引物F2-1、水解探针P2和下游引物；其中，所述上游引物F1从5’端至3’端依次由下述两部分组成：(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端依次为与上游引物F1-1相同的序列和与水解探针P1相同的序列；(2)匹配区：仅与突变型的突变位点上下游序列连续互补配对；所述上游引物F2从5’端至3’端依次由下述两部分组成：(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对，该不匹配区的序列从5’端至3’端依次为与上游引物F2-1相同的序列和与水解探针P2相同的序列；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：该组合物包括突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物；/n所述突变型检测用组合物包括上游引物F1、上游引物F1-1、水解探针P1和下游引物；/n所述野生型检测用组合物包括上游引物F2、上游引物F2-1、水解探针P2和下游引物组成；/n其中，/n所述上游引物F1从5’端至3’端依次由下述两部分组成：/n(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与上游引物F1-1相同的序列，和与水解探针P1相同的序列；/n(2)匹配区：仅与突变型的突变位点上下游序列连续互补配对；/n所述上游引物F2从5’端至3’端依次由下述两部分组成：/n(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对，该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与上游引物F2-1相同的序列，和与水解探针P2相同的序列；/n(2)匹配区：仅与野生型的突变位点及其上下游序列连续互补配对。/n

【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：该组合物包括突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物；
所述突变型检测用组合物包括上游引物F1、上游引物F1-1、水解探针P1和下游引物；
所述野生型检测用组合物包括上游引物F2、上游引物F2-1、水解探针P2和下游引物组成；
其中，
所述上游引物F1从5’端至3’端依次由下述两部分组成：
(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与上游引物F1-1相同的序列，和与水解探针P1相同的序列；
(2)匹配区：仅与突变型的突变位点上下游序列连续互补配对；
所述上游引物F2从5’端至3’端依次由下述两部分组成：
(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对，该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与上游引物F2-1相同的序列，和与水解探针P2相同的序列；
(2)匹配区：仅与野生型的突变位点及其上下游序列连续互补配对。


2.根据权利要求1所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述突变型检测用组合物和野生型检测用组合物中的下游引物相同。


3.根据权利要求1或2所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述水解探针P1的5’端和3’端上分别修饰报告基团和淬灭基团；所述水解探针P2的5’端和3’端上分别修饰报告基团和淬灭基团；优选地，水解探针P1和水解探针P2上的报告基团分别释放不同的检测信号。


4.根据权利要求1～3任意一项所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述上游引物F1的3’端第2～9个碱基处添加1～20个错配碱基；所述上游引物F2的3’端第2～9个碱基处添加1～20个错配碱基。


5.根据权利要求1～4任意一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雨航，葛志琪，
申请(专利权)人：迈克生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51