一种利用Taqman qPCR法鉴定SNP突变的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种利用Taqman qPCR法鉴定SNP突变的方法及试剂盒，包括以下步骤：步骤1)、针对需要检测的SNP位点分别合成正向PCR引物和反向PCR引物；步骤2)、针对需要检测的SNP位点分别合成针对两种SNP多态性的探针，两种探针使用一样的荧光淬灭染料对；步骤3)、在两个反应管中均加入模板DNA、2×PCR反应液、正向PCR引物和反向PCR引物，在两个反应管中分别加入针对两种SNP多态性的探针；进行Taqman qPCR检测；步骤4)、综合两个反应管的Taqman qPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态。本发明专利技术解决了现有Taqman qPCR检测SNP突变的方法建立所需优化时间较长、效率低的问题。

A method and kit for identification of SNP mutation by TaqMan qPCR

【技术实现步骤摘要】
一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法及试剂盒
本专利技术涉及SNP突变检测
，具体涉及一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法及试剂盒。
技术介绍
对于传统的TaqmanqPCR检测法，一般的思路是力图在一个反应管中加入多重Taqman探针，采用不同的染料、淬灭剂对，比如FAM/TAMRA对和VIC/TAMRA对，但是由于在一个反应管内加入了两对不同的染料/淬灭剂，两者之间大都存在相互干扰，一般需要较多轮次的调整和优化，如果不需要抢时间的话，上述思路是成立的。但是，往往的紧急情况不给人们充足的时间来调整优化方法，需要尽快推出简单易上手的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法及试剂盒，以解决现有TaqmanqPCR检测SNP突变的方法建立所需优化时间较长、效率低的问题。本专利技术通过下述技术方案实现：一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法，包括以下步骤：步骤1)、针对需要检测的SNP位点分别合成正向PCR引物和反向PCR引物；步骤2)、针对需要检测的SNP位点分别合成针对两种SNP多态性的探针，两种探针使用一样的荧光淬灭染料对；步骤3)、在两个反应管中均加入模板DNA、2×PCR反应液、正向PCR引物和反向PCR引物，在两个反应管中分别加入针对两种SNP多态性的探针，进行TaqmanqPCR检测；步骤4)、综合两个反应管的TaqmanqPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态；其中，步骤1)和步骤2)的顺序可交换。本专利技术通过合成针对需要检测的SNP位点的正向PCR引物和反向PCR引物、合成针对两种SNP多态性的探针，进行TaqmanqPCR检测，检测时将两种SNP多态性的探针分别加入两个试管，综合两个反应管的TaqmanqPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态。本专利技术所述方法检测时间短，操作简单，省去了一般传统方法中优化多重探针混合的步骤，能快速形成检测方法，用空间换取了时间精力，在某些紧急特殊的情况下有适用性，能争取到宝贵的时间和精力的节省，适用性好。如此，本专利技术解决了现有TaqmanqPCR检测SNP突变的方法建立所需优化时间较长、效率低的问题。进一步地，两种探针在5’端都用FAM染料标记，在3’端都使用淬灭剂TAMRA。进一步地，还包括步骤5)、利用一代DNA测序结果验证TaqmanqPCR检测结果。进一步地，TaqmanqPCR检测至少进行40个循环。进一步地，TaqmanqPCR检测的反应条件为：95℃反应10分钟，然后如下进行40个循环：95℃反应15秒，60℃反应1分钟。进一步地，TaqmanqPCR检测采用ABISteponePlus定量PCR仪。一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的试剂盒，包括：针对需要检测的SNP位点分别合成的正向PCR引物和反向PCR引物；针对需要检测的SNP位点分别合成的针对两种SNP多态性的探针，两种探针使用一样的荧光淬灭染料对。进一步地，还包括2×PCR反应液。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本专利技术通过合成针对需要检测的SNP位点的正向PCR引物和反向PCR引物、合成针对两种SNP多态性的探针，进行TaqmanqPCR检测，检测时将两种SNP多态性的探针分别加入两个试管，综合两个反应管的TaqmanqPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态。本专利技术所述方法检测时间短，操作简单，省去了一般传统方法中优化多重探针混合的步骤，能快速形成检测方法，用空间换取了时间精力，在某些紧急特殊的情况下有适用性，能争取到宝贵的时间和精力的节省，适用性好。如此，本专利技术解决了现有TaqmanqPCR检测SNP突变的方法建立所需优化时间较长、效率低的问题。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为采用本专利技术所述方法A管的杂合子模板DNA的TaqmanqPCR检测结果图；图2为采用本专利技术所述方法B管的杂合子模板DNA的TaqmanqPCR检测结果图；图3为采用一代DNA测序方法检测杂合子模板DNA结果图；图4为采用本专利技术所述方法A管的纯合子模板DNA的TaqmanqPCR检测结果图；图5为采用本专利技术所述方法B管的纯合子模板DNA的TaqmanqPCR检测结果图；图6为采用一代DNA测序方法检测纯合子模板DNA结果图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。实施例1：一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法，包括以下步骤：步骤1)、针对需要检测的SNP位点分别合成正向PCR引物和反向PCR引物；步骤2)、针对需要检测的SNP位点分别合成针对两种SNP多态性的探针，两种探针使用一样的荧光淬灭染料对，两种探针在5’端都用FAM染料标记，在3’端都使用淬灭剂TAMRA；步骤3)、在两个反应管中均加入模板DNA、2×PCR反应液、正向PCR引物和反向PCR引物，在两个反应管中分别加入针对两种SNP多态性的探针；进行TaqmanqPCR检测；步骤4)、综合两个反应管的TaqmanqPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态；其中，步骤1)和步骤2)的顺序可交换。本实施例以SNP位点rs4148323为试验对象进行试验，具体地：一、杂合子试验：从普通人体血液提取的基因组DNA，SNP位点rs4148323的基因序列如下：CAGCCACTGGCTGAGCATGCTTGGGGCCATCCAGCAGCTGCAGCAGAGGGGACATGAAATAGTTGTCCTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGAC[G/A]GAGCATTTTACACCTTGAAGACGTACCCTGTGCCATTCCAAAGGGAGGATGTGAAAGAGTCTTTTGTTAGTCTCGGGCATAATGTTTTTGAGAATGATTC其中，[G/A]为SNP的多态性位点。针对SNP位点rs4148323合成的正向PCR引物和反向PCR引物、针对两种SNP多态性的探针如表1所示：表1检测过程为：在A管、B管中均加入模板DNA、2×PCR反应液、正向PCR引物和反向PCR引物，在A管中分别加入8323#-Probe-1探针，在B管中加入8323#-Probe-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用Taqman qPCR法鉴定SNP突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1)、针对需要检测的SNP位点分别合成正向PCR引物和反向PCR引物；/n步骤2)、针对需要检测的SNP位点分别合成针对两种SNP多态性的探针，两种探针使用一样的荧光淬灭染料对；/n步骤3)、在两个反应管中均加入模板DNA、2×PCR反应液、正向PCR引物和反向PCR引物，在两个反应管中分别加入针对两种SNP多态性的探针，进行Taqman qPCR检测；/n步骤4)、综合两个反应管的Taqman qPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态；/n其中，步骤1)和步骤2)的顺序可交换。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)、针对需要检测的SNP位点分别合成正向PCR引物和反向PCR引物；
步骤2)、针对需要检测的SNP位点分别合成针对两种SNP多态性的探针，两种探针使用一样的荧光淬灭染料对；
步骤3)、在两个反应管中均加入模板DNA、2×PCR反应液、正向PCR引物和反向PCR引物，在两个反应管中分别加入针对两种SNP多态性的探针，进行TaqmanqPCR检测；
步骤4)、综合两个反应管的TaqmanqPCR检测结果，判断模板DNA对于被检测的SNP位点是杂合子还是纯合状态；
其中，步骤1)和步骤2)的顺序可交换。


2.根据权利要求1所述的一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法，其特征在于，两种探针在5’端都用FAM染料标记，在3’端都使用淬灭剂TAMRA。


3.根据权利要求1所述的一种利用TaqmanqPCR法鉴定SNP突变的方法，其特征在于，还包括步骤5)、利用一代DNA测序结果验证TaqmanqPCR检测结果。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：万谦，王锐锋，蒋小辉，向俊蓓，
申请(专利权)人：成都新生命霍普医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51