微卫星不稳定的预测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种微卫星不稳定的检测预测方法，以及相关的位点筛选方法、模型构建方法及应用。所述位点筛选方法：i)包含测定样本中候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值的步骤；和/或ii)使用包括候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值在内的一种或多种指标筛选用于微卫星不稳定检测的位点或位点组合；所述微卫星不稳定预测值是候选微卫星位点中主等位基因(allele)型与次等位基因型之间丰度差异的量化值。本发明专利技术的方法准确性高，仅基于单肿瘤样本就可以精准稳定地检测MSI状态。

Prediction method of microsatellite instability and its application

【技术实现步骤摘要】
微卫星不稳定的预测方法及其应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种微卫星不稳定的检测预测方法，以及相关的位点筛选方法、模型构建方法、标志物组合、试剂盒、系统、装置、计算机可读存储介质、设备，以及相关的微卫星不稳定量化方法。
技术介绍
微卫星(Microsatellites)序列是一些简单串联重复区域存在于人类基因组上数百万个基因座(loci)中。微卫星不稳定(Microsatelliteinstability，MSI)是指由于DNA错配修复缺陷(dMMR)导致的微卫星序列变长或变短的现象。这类体细胞突变可导致抑癌基因失活或破坏其他非编码调控序列，从而起到致癌作用。MSI发展至今成为临床关注的热点，主要原因在于免疫治疗对临床的冲击。在过去的几年中，癌症疗法已经得到了广泛的发展，人们认识到具有独特分子表型的不同癌症亚型可以使用新型靶向精准治疗。据报道，MSI作为这些独特的分子表型之一存在于多种癌症中，包括结直肠癌，子宫内膜癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌和成胶质细胞瘤等。在各类癌症类型中，尤其是结直肠癌中，MSI状态，特别是高水平的MSI状态(MSI-H)已经被认为是预后生物标志物，随后也有研究报道MSI状态被做为泛癌种免疫筛查点封锁反应的预后生物标志物，在2017年美国食品药品监督管理局(FDA)批准了派姆单抗作为细胞编程性死亡1(PD-1)抑制剂用于治疗具有高水平微卫星不稳定(MSI-H)或dMMR而没有其他治疗选择的所有晚期实体瘤患者。临床试验表明，免疫检查点抑制剂可改善多种实体瘤的疗效，这使MSI-H和dMMR成为治疗反应的首个全癌预测指标。因此，探究检测MSI状态的工具和方法在肿瘤临床诊断和预后治疗上具有重要意义。截至目前MSI检测方法主要有三种，免疫组化(Immunohistochemicalstains，IHC)、聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)和二代测序(next-generationsequencing，NGS)。IHC方法是利用FFPE肿瘤组织切片通过判断4种DNA错配修复蛋白(MLH1，PMS2，MSH2，MSH6)的表达情况来明确细胞是否存在错配修复功能缺陷。若结果显示任一蛋白表达缺失，则判读为dMMR；若四个蛋白全部表达，则判读为错配修复功能正常(pMMR)。其优势在于应用性广泛，并能确定哪些MMR蛋白在肿瘤中丢失，然而IHC存在检不到某些定性蛋白的变化，MMR结果偶有报错，以及结果判读因人而异等问题。PCR方法是通过比较肿瘤与非肿瘤组织DNA的微卫星序列长度的变化来鉴定肿瘤细胞是否存在dMMR，这种检测方法被广泛认为是MSI检测的金标准的诊断工具。通常检测至少5个以上的位点，1个位点不稳定称为低度微卫星不稳定(MSI-L)，2个及2个以上位点不稳定称为MSI-H，5个位点均稳定即微卫星稳定(MSS)。MSI-L和MSS等同于pMMR的概念，MSI-H等同于dMMR的概念。PCR检测MSI方法不仅弥补了IHC在因非截断式错义突变导致的MSI无法检出的漏洞同时还具备良好的可重复性，然而它也有局限性，包括基因组合(panel)的位点较少，通量较低，二核苷酸重复序列引起的MSI检测敏感性较低等。NGS方法是基于二代测序对待测样本在全基因组或全外显子组范围上进行MSI检测的方法。MSI作为生物标记主要作用是用于区分MSI突变表型并非是找出确定的MSI突变位置，因此，NGS方法弥补了PCR的通量低，panel小的问题，可与靶点突变检测、肿瘤突变负荷(TMB)等检测共用测序数据，检测位点可以根据检测目的自行调整省时省力、灵活方便。在目前已报道的NGS方法中，一般以PCR检测结果作为金标准，比较二者结果一致性作为评价NGS检测方法性能的标准。然而目前NGS方法繁多且多为配对方法，例如已发表的MSI检测工具mSINGS、MSIsensor、MANTIS等。随着MSI在临床上的广泛应用，与PCR和IHG方法相比NGS以其速度快、通量高、以及覆盖检测位点广的优势成为MSI临床检测的发展趋势。这就对NGS方法在准确性和可行性有了更高的需求，尤其是panel检测中表现优异的性能要求更加迫切，然而目前报道的NGS方法大多是基于肿瘤组织和对照组织比较的方法检测MSI，其检测标准参差不齐，在panel应用中性能表现也并不十分理想，这就限制了NGS方法在临床上的应用。通过思考和研究已有NGS方法的优势并结合panel分析具体案例数据，利用新的算法可以得到一种适用于panel分析基于单肿瘤样本的MSI检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种微卫星不稳定(MSI)的检测预测方法，以及相关的位点筛选方法、模型构建方法。专利技术人发现一种合理的算法拟合MSI分布可以极大改善现有NGS(下一代测序)方法检测MSI的性能，更重要的是，与现有方法相比，本专利技术的方法突破了已有NGS方法必须要有对照样本的限制，并且在panel分析应用中性能表现优异，具有更高的灵敏度、特异性和准确性。根据本专利技术方法的原理，其可嵌入各种已知的或将要开发的基因组合(panel)中，对panel检测范围内的微卫星区域进行简单重复序列定量(repeatcount)，基于微卫星区域定量结果利用本专利技术中的算法拟合每个MSI位点的MSI预测值并利用随机森林算法对MSI检测位点降噪、构建MSI分类模型(图1)，即可实现准确的预测。为了实现以上目的，本专利技术提供了一种微卫星不稳定(MSI)检测位点或微卫星不稳定检测位点组合的筛选方法，所述筛选方法：i)包含测定样本中候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值的步骤；和/或ii)使用包括候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值在内的一种或多种指标筛选用于微卫星不稳定检测的位点或位点组合；所述微卫星不稳定预测值是候选微卫星位点中主等位基因(allele)型与次等位基因型之间丰度差异的量化值。在本专利技术的具体实施方案中，等位基因型的丰度可以通过简单重复序列测序读长数目(repeatcount)计算。在本专利技术的具体实施方案中，等位基因型的丰度可以通过该基因型读段(reads)支持数计算。任选地，等位基因型的丰度通过归一化落在0-1区间内；优选地，等位基因型丰度归一化的方法可以是，用所述候选微卫星位点中所述等位基因型的读段支持数除以该位点所有等位基因型的读段支持数之和。本专利技术中，选择重复(repeat)长度在0-50bp之间的等位基因型进行计算。在本专利技术的具体实施方案中，所述筛选方法还包含通过样本中所有候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值计算样本的微卫星不稳定预测值的步骤。进一步地，所述样本的微卫星不稳定预测值按照以下公式计算：其中，f(x)表示样本的微卫星不稳定预测值，Xi1表示归一化的主等位基因型丰度，Xi2表示归一化的次等位基因型丰度，i为位点编号或位点顺序，n为位点数目。在本专利技术的具体实施方案中，所述候选微卫星位点可以是全基因组中的微卫星位点、外显子组中的微卫星位点、基因组中一个或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微卫星不稳定(MSI)检测位点或微卫星不稳定检测位点组合的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法：/ni)包含测定样本中候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值的步骤；和/或/nii)使用包括候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值在内的一种或多种指标筛选用于微卫星不稳定检测的位点或位点组合；/n所述微卫星不稳定预测值是候选微卫星位点中主等位基因(allele)型与次等位基因型之间丰度差异的量化值。/n

【技术特征摘要】
1.一种微卫星不稳定(MSI)检测位点或微卫星不稳定检测位点组合的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法：
i)包含测定样本中候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值的步骤；和/或
ii)使用包括候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值在内的一种或多种指标筛选用于微卫星不稳定检测的位点或位点组合；
所述微卫星不稳定预测值是候选微卫星位点中主等位基因(allele)型与次等位基因型之间丰度差异的量化值。


2.一种微卫星不稳定(MSI)检测模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法：
i)包含测定样本中候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值的步骤；和/或
ii)使用包括候选微卫星位点的微卫星不稳定预测值在内的一种或多种指标构建微卫星不稳定检测模型；
所述微卫星不稳定预测值是候选微卫星位点中主等位基因型与次等位基因型之间丰度差异的量化值。


3.一种微卫星不稳定的检测或预测方法，其特征在于，所述方法：
i)包含根据权利要求1所述的筛选方法筛选微卫星不稳定检测位点或检测位点组合的步骤；和/或
ii)使用根据权利要求1所述的筛选方法筛选得到的微卫星不稳定检测位点或检测位点组合进行检测；和/或
iii)使用根据权利要求2所述的构建方法构建得到的微卫星不稳定检测模型进行检测。


4.微卫星不稳定检测标志物组合，其特征在于，所述标志物组合是根据权利要求1所述的筛选方法获得的检测位点处的微卫星标志物组合。


5.用于特异性检测微卫星不稳定检测位点或检测位点组合的试剂在制备微卫星不稳定检测试剂盒和/或肿瘤伴随诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述微卫星不稳定检测位点或检测位点组合是根据权利要求1所述的筛选方法得到的微卫星不稳定检测位点或检测位点组合，或者是根据权利要求4所述的检测标志物组合，或者是根据权利要求2所述的构建方法构建的检测模型中的微卫星不稳定检测位点或检测位点组合。


6.一种微卫星不稳定检测试剂盒和/或肿瘤伴随诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于特异性检测微卫星不稳定检测位点或检测位点组合的试剂，所述微卫星不稳定检测位点或检测位点组合是根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴书昌，白健，王寅，
申请(专利权)人：福建和瑞基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35