融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用技术

本发明专利技术公开了融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用。该方法采用阴性DNA对融合基因阳性片段库进行稀释，得到包括至少1个稀释梯度的融合基因检测参考品；所述融合基因阳性片段库包括至少11个融合基因阳性片段。本发明专利技术采用多个融合基因阳性片段，检测覆盖范围广，为将来克服DNA层面融合检测难、漏检多提供了一个新思路，为融合基因检测产品的性能评价标准提供了一个检测的样板，为融合检测技术的进步提出了一个新指标，具有广泛的应用前景和巨大的产业价值。

【技术实现步骤摘要】
融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用。
技术介绍
在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。2020年，从美国癌症协会在《临床肿瘤杂志》上发表的统计数据来看，肺癌、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌一直高居榜首。得益于精准医疗的发展，基因检测作为对肿瘤检测的有效手段，为肿瘤的精准治疗提供了重要的信息和技术支持。目前已有报道中，实体瘤的成因，除了已经确定的驱动基因的突变，如EGFR、KRAS、BRAF等基因，和ERBB2、MET等基因的扩增之外，还包括ALK、ROS1、RET等基因的融合导致融合基因的形成。所谓融合基因，指的是某个原癌基因与另一基因，即伴侣基因发生了基因层面的融合。融合基因能够驱动细胞内促进细胞增殖的蛋白大量合成，进而引起细胞的大量增殖，最终导致癌症发生与进展。基因的融合是血液恶性肿瘤和实体瘤的重要遗传学变化，比如BCR-ABL融合基因就是慢性粒细胞白血病诊断/治疗期间需要检测一个重要指标；临床上也常把EML4-ALK阳性的非小细胞肺癌患者作为用药克唑替尼的依据。在非小细胞肺癌中，常见融合基因有ALK(3％～7％)、ROS1(1％～2％)、NTRK(3.3％)和RET(0.7％～2％)，这些基因与癌症的发生发展及靶向药物治疗都有着密切的关系。ALK融合是非小细胞肺癌的关键驱动机制之一，在NSCLC患者中发生的频率约为3-7％。针对ALK融合的抑制剂克唑替尼、色瑞替尼以及Alectinib在治疗ALK融合阳性的NSCLC患者中都取得了巨大成功，而ALK融合检测是靶向ALK治疗的前提。ROS1基因的重排最开始是在人脑胶质瘤细胞系里被鉴定出来，后续在其他几个恶性肿瘤里也发现了ROS1基因的重排，如胆管癌、卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌，其中在非小细胞肺癌里的突变频率为1％-2％。ROS1的重排导致激酶持续激活，上调SHP-1、SHP2以及PI3K、AKT、mTOR、MAPK和ERK信号通路，导致细胞持续增殖，肿瘤发生。ALK和ROS1的激酶活性区域有70％的相似性，因此ALK的抑制剂很多是可以用于ROS1的治疗的，目前有靶向药物克唑替尼批准。另一个常见融合基因是RET基因，2012年在NSCLC上首次发现RET重排，目前已发现至少12种融合变体，其中KIF5B-RET为最常见类型。KIF5B-RET融合基因是一种新的致癌驱动突变，存在于一部分非小细胞肺癌中，目前多靶向激酶抑制剂治疗RET融合NSCLC的ORR16％-47％，PFS2.3～7.3个月。除此之外还有NTRK基因，正常的NTRK基因负责编码原肌凝蛋白受体激酶(TRK)蛋白，作用是维持神经细胞的存活和正常功能。但若NTRK发生了融合突变，就会编码不正常的TRK蛋白，使细胞异常增殖，从而导致肿瘤的发生。NTRK融合包括NTRK1、NTRK2或者NTRK3基因融合，已被发现与多种肿瘤的发生发展有关。虽然在常见肿瘤如肺癌、结直肠癌中突变率低于5％，但几乎每一种癌症都报道有NTRK融合。特别是在一些罕见肿瘤中，如唾液腺癌、婴儿型纤维肉瘤，突变率超过90％。Larotrectinib是目前唯一一个获批用于NTRK融合的靶向药，针对的是NTRK1、NTRK2或者NTRK3基因融合的肿瘤患者。EGFR基因作为非融合基因主要用于融合片段库的定量检测。目前，对于融合基因的检测技术主要有以下几种：(1)荧光原位杂交检测技术(FISH)，这种方法是基因融合检测的金标准。荧光原位杂交可以检测DNA层面目标基因在染色体中的定位，从而判断是否有基因异位的发生，但实验操作复杂、技术要求较高，且只能在显微镜下目测细胞，观察到的细胞有限，可能存在漏检的情况。(2)免疫组化检测技术(IHC)，这种方法是目前临床检测的常用方法之一，免疫组化是一种通过特异性抗体与融合蛋白相结合，检测目标融合蛋白表达水平的方法，其不仅能够从蛋白层面检测是否发生了基因融合，还能够对融合蛋白的表达进行定量，但缺点是通常无法从DNA层面直接检测融合基因，且免疫组化对结果的判读主观性较强，容易导致较高的假阳性率。(3)反转录qPCR(RT-qPCR)检测，其优点是可操作性强，设计出针对已知融合基因的PCR引物，能简便快速地进行检测和判断，但缺点也很明显，RT-qPCR仅针对RNA样本检测，对RNA样本的质量要求高，其结果容易受到PCR抑制物的影响。上述三种技术只适用于肿瘤组织样本的检测，限制了应用的拓展，因为很多晚期癌症患者无法进行手术取样，因此无法使用这些检测技术检测融合基因的状态。由于高通量测序(NGS)检测技术可以一次检测多种基因、多种融合变体，发现未知变异，目前已有相应的检测panel获得了NMPA的批准，可用于临床检测。虽然高通量测序对融合基因的检测极具技术优势和发展前景，但从DNA层面的检测来看，依然存在许多问题。其一是市面上常见的融合基因检测产品检测性能参差不齐，针对穿刺组织或肿瘤细胞含量较低的病理样本检测容易出现漏检的情况。其二是行业内并没有一个统一的标准或规范来评价融合基因检测产品的检测性能，因此，有必要提供参考品或标准品对融合基因检测产品进行检测，用作评价融合基因检测产品的依据。目前市面上已有各种融合参考品，但仍存在以下问题：其一是现有的融合参考品检测位点少，现有已知的融合基因检测参考品，每一种参考品仅能检测某一到两个基因的某几个特定位点的融合突变，并不能够客观的评价出融合基因检测产品的实际性能，且检测的效率低。其二是多位点融合参考品制备工艺复杂，目前常规的融合参考品制备工艺包括突变细胞系包埋、转染获得突变单克隆细胞系的基因组提取、重组克隆质粒。但这些现有的制备工艺只适用于制备10个以内的位点，制备10个以上位点的多位点融合参考品工艺复杂。其三是DNA多位点融合参考品的质控成本高，质控难度大。现行的融合参考品在制备完成后通常是采用ddPCR方式对每一种频率的每一个位点进行精确定量，从而确定参考品定量的准确性。然而针对于多个位点的融合参考品，由于ddPCR定量方式的特殊性，需要对每一种位点进行单独定量，其定量效率低下；且每一种融合基因都需要针对性的设计特异性的ddPCR探针和引物，实际操作成本高难度大，此外，由于部分DNA融合基因常发生于重复区序列，这导致了ddPCR定量结果存在不可靠性。因此，缺乏一种简单高效的手段对多位点的融合参考品进行定量。其四是市场上现有的DNA融合参考品对基因检测panel的评估存疑。针对实体瘤常见的融合基因，如ALK、ROS1、RET等基因，其常见的融合发生区域大小为4000-10000bp，而现有的DNA融合参考品仅仅针对期间某一到两个特定的位点进行融合检出的评定，就宣称其能够评估出整个基因的融合检出性能，这样以偏概全的评估方式，导致其评估结果的真实性存在质疑。其五是融合基因检测产品测试成本高，由于现有已知的融合基因检测参考品，每种参考品的检测位点仅为1到10个。针对大panel或者多融合基因检测产品的测试，需要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高通量测序方法在制备或检测融合基因阳性片段库，或者在制备或检测融合基因检测参考品中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.高通量测序方法在制备或检测融合基因阳性片段库，或者在制备或检测融合基因检测参考品中的应用。


2.一种融合基因阳性片段库的制备或检测方法，其特征在于，所述制备或检测方法包括，采用高通量测序方法检测不同阳性片段混合得到的融合基因阳性片段库中各阳性片段之间的数量比；
所述融合基因阳性片段库的制备方法还包括调整融合基因阳性片段库中各阳性片段数量的步骤。


3.根据权利要求2所述的制备或检测方法，其特征在于，所述高通量测序方法检测的步骤包括，融合基因阳性片段库中各阳性片段依次经过打断、修复、连接和纯化处理后，采用高通量测序方法对各阳性片段进行均一性评价；
优选地，所述均一性评价包括评价融合基因阳性片段库中各阳性片段的拷贝数；
优选地，所述各阳性片段的拷贝数通过检测序列深度获得。


4.采用权利要求2或权利要求3所述制备方法得到的融合基因阳性片段库；
优选地，所述融合基因阳性片段库中各阳性片段等摩尔混合；
优选地，所述融合基因阳性片段库中融合基因阳性片段的总浓度为2～10ng/μL。


5.ddPCR在制备或检测融合基因检测参考品中的应用。


6.一种融合基因检测参考品的制备或检测方法，其特征在于，所述制备或检测方法包括，采用ddPCR检测融合基因检测参考品中各阳性片段的突变频率，所述融合基因检测参考品包括采用阴性DNA对标记位点阳性片段与融合基因阳性片段混合物稀释得到的融合基因检测参考品；所述制备或检测方法还包括，采用高通量测序方法检测融合基因检测参考品中各阳性片段之间的数量比；
优选地，所述标记位点阳性片段的数量至少为2个。


7.采用权利要求6所述制备方法得到的融合基因检测参考品；
优选地，所述融合基因检测参考品包括肿瘤组织参考品，所述肿...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，齐翠肖，郭委，屈紫薇，王寅，白健，吴琳，
申请(专利权)人：福建和瑞基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35