一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法，本发明专利技术方法能够同时实现DNA分子的自由捕获和多自由度纳米操纵，基于纳米操纵的纳米孔测序方法基于原位的纳米操纵纳米孔制备技术，制备孔径、间距可控的双纳米孔，并控制制备纳米探针与双纳米孔的相对位移；加入能够被双纳米孔捕获并识别的DNA分子，待DNA分子被双纳米孔自由捕获后，操纵纳米探针在双纳米孔之间拨动DNA分子，并依据测序需求进行纳米操纵。通过检测DNA分子被匀速操纵进入和退出纳米孔的电流信号，进而分析出待测DNA分子的序列信息。该方法解决了单分子的操纵问题，进而解决纳米孔测序的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法
本专利技术属于测量
，其涉及一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法，其可以适用于使用纳米孔进行DNA分子测序。
技术介绍
纳米孔测试技术兴起于20世纪90年代，并为了实现纳米孔测序而蓬勃发展起来。1996年，研究人员采用生物纳米孔实现了DNA分子的过孔检测，经历了16年的发展，于2012年被证明可以进行DNA分子测序，并于2014年由英国牛津纳米孔公司推出第一台商用的DNA测序仪。纳米孔测序仪的核心技术包括纳米孔的稳定性控制，检测空间分辨率和时间分辨率的提高。生物纳米孔优先于固体纳米孔推出测序仪的主要原因是其孔径稳定，保证了测序信号的一致性。并且采用分子马达(聚合酶或者解旋酶)进行时间分辨率的控制，可以将DNA分子的过孔速度降低到仪器能够识别的水平。但是分子生物马达控制DNA分子仍然存在一系列问题，首先，分子马达和生物纳米孔均固定在脆弱的凝脂双分子层上，受环境等因素影响较大，并且在使用过程中容易被破坏；其次，分子马达对DNA分子的操纵是其自身生物作用力决定的，虽然可以通过调节温度，PH值以及设计不同类型的分子马达解决，但是这种不确定性仍然会对最终的检测精度带来极大的影响；最后，分子马达控制的是DNA分子的解旋或者聚合，是基于DNA解旋或者聚合的机理进行速度控制的，具有DNA分子的选择局限性。因此，采用更为直接的纳米操纵技术去解决分子序列过孔的速度问题尤为必要。磁镊、光镊、原子力探针、光纤探针、硅探针以及双纳米孔系统等均为一些可行的方法。其中，磁镊、光镊、原子力探针、光纤探针等具有较高的操纵精度和自由度，但是操纵分子被捕获的几率较小；硅探针解决了捕获率的问题，但是相邻间分子的干扰无法去除；双纳米孔系统具有一定的可行性，但是将双纳米孔系统分开检测在工程上还无法实现。
技术实现思路
基于现有技术存在的技术问题，本专利技术提供一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法，其基于纳米操纵的纳米孔测序方法基于原位的纳米操纵纳米孔制备技术，通过检测DNA分子被匀速操纵进入和退出纳米孔的电流信号，进而分析出待测DNA分子的序列信息；该方法解决了单分子的操纵问题，进而解决纳米孔测序的问题。依据本专利技术的技术方案，提供一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法，其以下步骤。步骤S1,搭建基于纳米操纵的纳米孔制备系统。步骤S2,设计DNA文库分子，即将DNA文库分子作为DNA测序信号的起始/终止信号标记，又作为双纳米孔捕获DNA分子的判别依据，还作为将DNA分子固定在双纳米孔之间并可以被探针所拨动的分子靶标。步骤S3,制备待测溶液；将待测DNA分子修饰到DNA文库上。步骤S4,监控待测DNA分子被捕获的情况；加入修饰完成的DNA分子溶液，通过检测电流信号观察DNA分子被双纳米孔捕获的情况。步骤S5,操纵纳米探针与DNA文库分子接触。步骤S6,操纵DNA分子退出和进入纳米孔。步骤S7,分析纳米孔DNA测序信号。其中，纳米孔制备系统包括三维纳米操纵平台、纳米探针电极、纳米薄膜芯片、电极夹持器、缓冲池、光源、显微镜、恒流源、微弱电流检测系统和法拉第屏蔽罩，各个部件之间的连接或位置关系为纳米探针电极固定在电极夹持器上，电极夹持器固定在三维纳米操纵平台上；纳米薄膜芯片安装在缓冲池中，纳米薄膜芯片通过缓冲池中下层溶液与恒流源连接以及与微弱电流检测系统的负端连接；纳米探针电极连接到恒流源的正端，当纳米探针电极与纳米薄膜芯片接触时，形成恒流源的电流回路；当缓冲池上层加入缓冲液后，微弱电流检测系统的正端电极浸入到溶液中，形成检测电路通路，并且DNA文库分子和DNA分子可以在溶液内进行布朗运动；当微弱电流检测系统施加电压时，DNA文库分子和DNA分子会部分被第一纳米孔和第二纳米孔捕获；显微镜和光源位于纳米探针电极的左右两边，形成反射回路，便于观察纳米探针与纳米薄膜芯片的接触情况；法拉第屏蔽罩屏蔽三维纳米操纵平台、纳米探针电极、纳米薄膜芯片、电极夹持器、缓冲池、光源、显微镜、恒流源和微弱电流检测系统，并留有小孔作为三维纳米操纵平台、纳米探针电极、纳米薄膜芯片、电极夹持器、缓冲池、光源、显微镜、恒流源和微弱电流检测系统与其电路控制系统连接的线孔。优选地，纳米探针电极为针尖小于1um的纳米尺度导电电极。更优选地，纳米探针电极为纳米级的金、铂、银电极探针，或者是经过镀金处理的纳米级钨钢针或者是光纤探针，或者是纳米级填充有导电溶液的玻璃微管。优选地，纳米探针电极通过电极夹持器固定在三维纳米操纵平台上，受平台的控制，实现多自由度的高精度纳米运动。此外，所述的起始/终止信号标记，是指当经过设计的DNA分子进入或者退出纳米孔时，其被检测电路所识别的信号是已知的，该位点也是待测分子与文库分子结合位点。优选地，DNA分子修饰是指将待测DNA分子与DNA文库分子通过生物，物理化学的方法结合。优选地，被捕获信号为设计的DNA分子的过孔信号被电流检测系统检测到，并且是被两个纳米孔都捕获到。进一步地，DNA分子退出和进入纳米孔是指待测DNA分子在纳米探针拨动DNA文库分子运动时被带动的运动情况；该运动速度可以通过设置纳米操纵系统的控制参数进行灵活控制。更进一步地，分析纳米孔DNA测序信号包括判别待测DNA分子进入和退出纳米孔的起始或者终止信号、双纳米孔系统不同纳米孔的过孔信号、双纳米孔系统的差分信号的累加信号。相比较于现有技术，本专利技术的基于纳米操纵的纳米孔测序方法能够使用纳米孔进行DNA分子测序，尤其能够控制DNA分子进入和退出纳米孔，实现DNA分子的直接测序。该测序方法解决了分子马达易疲劳和选择性的问题，提高了传统纳米操纵DNA分子进入纳米孔捕获率低的问题，尤其能够拓展到RNA分子和蛋白质分子等测序领域。本专利技术的基于纳米操纵的纳米孔测序方法基于原位纳米操纵纳米孔制备技术，制备孔径、间距可控的双纳米孔，并通过纳米探针操纵DNA分子进入和退出双纳米孔系统，实现DNA分子的测序。本专利技术的方法还具有以下优点。1、纳米操纵不受环境和时间因素的影响，具有多自由度和控制精度高的优点。2、纳米探针和纳米孔的位置精确可控，不需要重复定位。3、双纳米孔系统的孔径和间距灵活可调，并处于同一测量环境下，通过计算双纳米孔的差分信号，可以进一步的提高纳米孔测序的分辨率。4、DNA分子自由运动与纳米操纵相结合，解决了传统方法固定DNA分子操纵的捕获率低问题。5、纳米操纵整个过程为物理作用力，不涉及到化学和生物作用匹配的影响，因此可以直接扩展到RNA和蛋白质测序。附图说明图1是依据本专利技术基于纳米操纵的纳米孔测序方法的DNA测序原理图。图2是依据本专利技术的纳米孔制备和DNA测序仪器结构图。图3是依据本专利技术的分离电极双纳米孔测序结构图。图4是依据本专利技术的DNA测序过孔信号图。其中附图标记如下：1：三维纳米操纵平台，2：纳米探针，3：纳米薄膜芯片，4：第一纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法，其特征在于：其包括以下步骤：/n步骤S1,搭建基于纳米操纵的纳米孔制备系统；/n步骤S2,设计DNA文库分子，将DNA文库分子作为DNA测序信号的起始/终止信号标记，又作为双纳米孔捕获DNA分子的判别依据，还作为将DNA分子固定在双纳米孔之间并可以被探针所拨动的分子靶标；/n步骤S3,制备待测溶液，将待测DNA分子修饰到DNA文库上；/n步骤S4,监控待测DNA分子被捕获的情况，加入修饰完成的DNA分子溶液，通过检测电流信号观察DNA分子被双纳米孔捕获的情况；/n步骤S5,操纵纳米探针与DNA文库分子接触；/n步骤S6,操纵DNA分子退出和进入纳米孔；/n步骤S7，分析纳米孔DNA测序信号。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米操纵的纳米孔测序方法，其特征在于：其包括以下步骤：
步骤S1,搭建基于纳米操纵的纳米孔制备系统；
步骤S2,设计DNA文库分子，将DNA文库分子作为DNA测序信号的起始/终止信号标记，又作为双纳米孔捕获DNA分子的判别依据，还作为将DNA分子固定在双纳米孔之间并可以被探针所拨动的分子靶标；
步骤S3,制备待测溶液，将待测DNA分子修饰到DNA文库上；
步骤S4,监控待测DNA分子被捕获的情况，加入修饰完成的DNA分子溶液，通过检测电流信号观察DNA分子被双纳米孔捕获的情况；
步骤S5,操纵纳米探针与DNA文库分子接触；
步骤S6,操纵DNA分子退出和进入纳米孔；
步骤S7，分析纳米孔DNA测序信号。


2.根据权利要求1所述的基于纳米操纵的纳米孔测序方法，其特征在于：纳米孔制备系统包括三维纳米操纵平台(1)，纳米探针电极(2)、纳米薄膜芯片(3)、电极夹持器(101)、缓冲池(104)、光源(102)、显微镜(103)、恒流源(105)、微弱电流检测系统(106)和法拉第屏蔽罩(107)，纳米探针电极(2)固定在电极夹持器(101)上，电极夹持器(101)固定在三维纳米操纵平台(1)上；纳米薄膜芯片(3)安装在缓冲池(104)中，通过缓冲池(104)中下层溶液与微弱电流检测系统(106)的负端连接；纳米探针电极(2)连接到恒流源(105)的正端，当纳米探针电极(2)与纳米薄膜芯片(3)接触时形成恒流源(105)的电流回路；当缓冲池(104)上层加入缓冲液后，微弱电流检测系统(106)的正端电极浸入到溶液中，形成检测电路通路，并且DNA文库分子(6)和DNA分子(7)在溶液内进行布朗运动；当微弱电流检测系统(106)施加电压时，DNA文库分子和DNA分子(7)会部分被第一纳米孔(4)和第二纳米孔(5)捕获；显微镜(102)和光源(103)位于纳米探针电极的左右两边，形成反射回路，便于观察纳米探针(2)与纳米薄膜芯片(3)的接触情况；法拉第屏蔽罩(107)屏蔽三维纳米操纵平台(1)、纳米探针电极...

【专利技术属性】
技术研发人员：方绍熙，王德强，袁家虎，何石轩，殷博华，谢婉谊，石彪，罗志勇，唐鹏，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50