【技术实现步骤摘要】
一种在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种利用BG4重组蛋白在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体(G4)位点的新方法。
技术介绍
在真核生物基因组中,双链或单链DNA中富含鸟嘌呤(G)的某些区域,通过形成Hoogsteen氢键来稳定四个鸟嘌呤的平面结构,多个鸟嘌呤结构能够形成一个三维立体的四鸟嘌呤柱状体结构,这种结构称为DNA鸟嘌呤四联体结构(G-quadruplex,G4)(Quetal.,2018,AnalChem,90:12051-12058)。人类相关研究结果表明,G4结构在肿瘤基因的端粒维持、复制、转录和翻译等多种生物学过程中发挥着重要作用(Kumetaretal.,2011,NucleicAcidsRes.39:8005-8016),特别是,G4在肿瘤端粒中生理功能相对比较活跃。但也有研究表明,DNAG4结构不仅广泛分布于癌变细胞中,而在正常细胞中也普遍存在。人体癌细胞系的研究表明,G4位点多集中在DNA端粒区并与DNA损伤修复机制可能有一定的相关性,表明DNAG4可能参与细胞对逆境胁迫下的防御反应,甚至参与到逆境损伤修复过程,从而推动了G4位点作为癌症治疗药物的靶标位点的应用转化研究。从而表明,G4是真核生物基因组中具有行使一定生物学功能的一种DNA高级结构,而不仅仅是冗余的基因组DNA序列。目前,用于鉴定人类细胞系G4结构的ChIP(Chromatinimmunoprecipitation)反应的抗体主要有B ...
【技术保护点】
1.一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNA G4位点的方法,其特征在于,该方法主要包括如下步骤:/n(1)交联固定植物材料;/n(2)提取并纯化植物材料的细胞核;/n(3)对细胞核内染色质进行片段化处理,选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应,回收DNA片段;/n(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer中进行变复性反应;/n(5)将IP Buffer加入到变复性产物中,继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物;/n(6)用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物;/n(7)从Beads上洗脱IPed DNA,并用醇沉法回收DNA片段;/n(8)用qPCR方法检测DNA G4富集程度;/n(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序,经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。/n
【技术特征摘要】
1.一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNAG4位点的方法,其特征在于,该方法主要包括如下步骤:
(1)交联固定植物材料;
(2)提取并纯化植物材料的细胞核;
(3)对细胞核内染色质进行片段化处理,选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应,回收DNA片段;
(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer中进行变复性反应;
(5)将IPBuffer加入到变复性产物中,继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物;
(6)用ProteinGBeads回收过夜反应形成的IP反应复合物;
(7)从Beads上洗脱IPedDNA,并用醇沉法回收DNA片段;
(8)用qPCR方法检测DNAG4富集程度;
(9)将经过富集程度检测的IPDNA进行建库和Illumina测序,经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中交联固定植物材料的过程为:将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中,在真空条件下进行交联反应;再向交联固定液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理使多余的交联剂失活,最后得到交联固定的植物材料;将交联固定的植物材料清洗后吸干表面的水分,用锡铂纸包裹并于液氮中速冻后于-80℃保存待用;
所述的交联固定液包括:50mMHEPES、1mMEDTA、0.1MNaCl、1mMPMSF和终浓度为1%的甲醛;所述甘氨酸溶液的终浓度为125mM。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中提取并纯化植物材料细胞核的过程为:将交联后的植物材料用液氮研磨成粉末后,往粉末中加入核提取缓冲液,搅拌成匀浆后于冰上放置;然后过滤、离心、并且弃上清,再加入细胞核清洗液重悬细胞核,再次离心,弃上清液对细胞核进行纯化,重复细胞核清洗过程直到细胞核颜色为白色或淡黄色,用RSB缓冲液重悬细胞核,离心后弃尽上清,保留沉淀,即得到纯化的细胞核;
所述核提取缓冲液的配方为:20mMTris-HCl、50mMEDTA、5mMSpermidine、0.15mMspermine、40%Glycerol、0.1%Mercaptoethanol;
所述细胞核清洗液的配方为:20mMTris-HCl、50mMEDTA、5mMSpermidine、0.15mMspermine、40%Glycerol、0.1%Mercaptoethanol、0.5%TritonX-100;
所述RSB缓冲液的配方为:10mMTris-HCl、10mMNaCl、3mMMgCl2。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中对细胞核内染色质进行片段化处理和解交联反应的过程为:将纯化后的细胞核充分重悬于裂解缓冲液中,用非接触式超声波破碎仪处理细胞核悬浮液3~15个循环,检测片段化程度,如果经过片段化处理的DNA均匀的分布在100~500bp,则加入解交联试剂进行解交联反应;然后向反应液中加入RNaseA,于37℃水浴中孵育后,再加入ProteinaseK,于55℃水浴中孵育;用等体积的酚仿(1:1)抽提离心后保留上清液并加入Glycogen,1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇,混匀后于-20℃放置1h后,离心回收DNA,DNA沉淀用75%酒精清洗干燥后,用EB溶解;
所述裂解缓冲液的配方为50mMTris-HCl、10...
【专利技术属性】
技术研发人员:张文利,冯逸龙,陶申童,张鹏越,高静静,罗振宇,
申请(专利权)人:南京农业大学,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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