一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法及其应用及其试剂盒技术

一种应用免疫组库测序方法分析样本中淋巴细胞或浆细胞的方法：获取样本总mRNA并利用TCR/BCR恒定区特异性引物逆转录获取cDNA分子，以cDNA分子3'端通用序列为上游引物、基于恒定区设计下游引物进行第一次PCR，并在上游引入UMI序列；取第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR反应，获得包含可变区CDR3全长序列及UMI的产物；进行测序，利用UMI校正并构建一致性序列，组装一致性序列获得若干克隆；获取克隆数据并基于鉴定的克隆获取V(D)J组合和CDR3序列，进行淋巴细胞或浆细胞的分析。本发明专利技术基于RNA免疫组库测序、分子标记获取校正的序列信息，灵敏度高、操作简单，能获取准确度高的分析结果。

【技术实现步骤摘要】
一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法及其应用及其试剂盒
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法及其应用及其试剂盒。
技术介绍
淋巴细胞包括B细胞和T细胞，其是人体内唯一基因组有别于其他体细胞的细胞群。B细胞和T细胞分别介导机体的体液免疫应答和细胞免疫应答，分别通过其对应的表面细胞受体BCR、TCR来识别抗原，进而发挥清除病原体的功能。BCR和TCR都由可变区和恒定区组成，不同细胞的恒定区可相同，但可变区不同，因而具有识别抗原多样性的能力。比如，新型冠状病毒通过呼吸道进入人体肺脏和肺上皮细胞表面受体结合，并借此侵入肺上皮细胞大量繁殖释放新的病毒并感染其他体细胞；肺泡巨噬细胞吞噬细胞碎片和病毒颗粒，病毒在巨噬细胞中被灭活，病毒蛋白被消化成肽链；部分肽链和巨噬细胞表面的HLA(MHC)分子结合，并通过T细胞表面受体TCR识别特定的T细胞；当HLA-肽链-TCR复合体高度亲合时，该T细胞被激活，扩增，形成克隆。当病毒持续存在或二次感染时，该克隆便快速增殖，产生细胞因子和效应T细胞清除病毒，这就是获得性细胞免疫的克隆选择。B细胞可通过自身膜免疫球蛋白(Ig)直接识别病毒表面抗原(如新型冠状病毒的S蛋白)，当Ig分子的可变区与病毒蛋白高度亲和时，该B细胞被激活，扩增，形成克隆，成为记忆细胞。当病毒持续存在或二次感染时，该克隆能快速增殖并分化成浆细胞，产生相应抗体中和病毒，这就是获得性体液免疫的克隆选择。由于病原体往往携带多种抗原，所以可能同时诱导多个T细胞和B细胞的克隆，即多克隆。与上述状态类似但具有本质性区别的是：淋巴系统(包括浆细胞)肿瘤是一种单克隆淋巴细胞或浆细胞增殖性疾病。由于尚未完全明了的病因(病毒、致癌物、免疫缺陷等)，致使某一淋巴细胞的特定基因产生突变获得生长优势表型，并逃逸了体内免疫监视，可无限制生长形成一个优势克隆，即为单克隆。这些单克隆细胞形成淋巴造血系统恶性疾病包括急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和浆细胞性肿瘤等。这些克隆性恶性细胞存在于正常淋巴细胞包括T细胞、B细胞和浆细胞群中，只有用特定的检测方法才能鉴别出来这些克隆。该专利技术提供了这样一种检测方法。所以，对血液或骨髓中淋巴细胞或浆细胞的分析显得至关重要，通过分析是否有优势克隆即单克隆，有助于判断淋巴细胞、浆细胞的克隆性质为反应性表现为良性的多克隆还是增殖性表现为恶性的单克隆，从而有助于及时诊断是否有淋巴系统肿瘤或浆细胞疾病。从而尽早开展治疗，提供个体化治疗的依据，指定有效的治疗方案，提高患者的生存率。同时，随着血液学的不断发展，淋巴系统肿瘤或浆细胞疾病能通过诱导化疗、靶向治疗、骨髓移植治疗等方式得到缓解，但仍会存在复发的状况。MRD是导致复发的首要原因。所述MRD是指治疗后体内仍残留有少量白血病、淋巴瘤或浆细胞骨髓瘤细胞的状态。所以，通过对血液或骨髓中淋巴细胞或浆细胞的分析还有助于实现对MRD的监测，从而及时预测复发情况以及残留量，为判断预后和病情提供依据，并依此制定有效治疗方案。目前，对淋巴细胞或浆细胞的检测分析有很多方法。如多参数流式细胞术(MFC)以及多重PCR检测BCR和TCR等，但该类方法均存在较大缺陷。如MFC检测不表达或丢失Ig的B细胞肿瘤时即无法实现测定，而多重PCR检测BCR和TCR方法又常常不能保证完全扩增免疫组库各链分子，容易导致假阴性结果。现有技术也提出基于二代测序(NGS)的分析方法，如，通过测定全部T细胞和B细胞受体TCR和BCR基因组以检测克隆性和MRD。但迄今为止，国内外基于NGS的检测方法大都是以DNA-Seq为基础的方法；该类方法同样存在较大缺陷，包括扩增体系复杂不能有效扩增、容易发生偏倚、PCR体系较大成本较高、灵敏度低、模板需求量大等缺陷，仍然不能满足目前对淋巴细胞或浆细胞分析检测的需求。所以，亟需一种分析淋巴细胞或浆细胞的方法，便于高灵敏度的进行淋巴细胞或浆细胞分析并获得准确度高的分析结果，更需应用于淋巴细胞或浆细胞的克隆性分析和微小残留疾病上的方法，以克服现有技术分析方法所存在的缺陷，为诊断疾病、制定有效的治疗方案提供依据。为此，本专利技术基于应用专利申请号为201810618023.7的基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法的软件系统设计应用于淋巴细胞或浆细胞分析的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，该方法以mRNA为模板对免疫组库进行NGS建库测序，结合分子标记能获取纠正的、不含内含子的序列信息，偏倚少，有效序列信息含量高，从而便于分析样本淋巴细胞或浆细胞以获取准确度高的分析结果。本专利技术采取的技术方案是，一种应用免疫组库测序方法分析样本中淋巴细胞或浆细胞的方法，所述的免疫组库测序方法即为专利申请号为201810618023.7的专利文件的基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法，包括步骤：S1、获取骨髓或外周血样本细胞总mRNA，利用TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录，获取含有mRNA5'端全部序列的cDNA分子；为了方便样本的留存和mRNA的提取，所述骨髓可以为抗凝骨髓，抗凝剂采用EDTA或枸橼酸钠；进一步的，当骨髓或外周血细胞为起始样本时，直接裂解细胞并使用带PolyT的磁珠捕获mRNA；获取mRNA后利用逆转录酶和TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录；且为了获取含有mRNA5’端全部序列的cDNA分子，采用具有末端转移酶活性的逆转录酶，所述逆转录酶添加若干“C”碱基至cDNA分子的3’端，以便后续延伸模板的形成，从而使得后续获得的cDNA分子含有mRNA5’端全部序列；进一步的，步骤S1中使用MMLVRT逆转录酶进行逆转录，并在逆转录至RNA分子5’末端时在产生的cDNA分子3’端加上若干“C”碱基，利用锁核酸修饰的模板转换引物与所加的若干C碱基配对产生延伸模板，从而使后续所得cDNA分子含有mRNA5'端全部序列；并在产生延伸模板后还使用UDG酶处理以进行碱基错配的修复；进一步的，采用磁珠回收逆转录产物并作为步骤S2的PCR模板。S2、结合以cDNA分子3'端通用序列的上游引物、基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物进行第一次PCR反应，且所述上游引物中引入UMI序列；所述UMI序列可采用申请号为：201810618023.7的专利文件中的UMI序列，通过UMI序列可实现序列的标记，有助于后续基于UMI进行序列的纠正，从而获取有效的序列信息，提高检测的准确程度。且基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物单引物能实现等效扩增，相比于现有技术中基于DNA的免疫组库测序检测淋巴细胞，检测准确程度高，且偏倚少。S3、取一部分纯化后的第一次PCR产物作为模板，并以其两端的通用序列作为上下游引物进行第二次PCR反应，经过两轮PCR后获得包含TCR/BCR可变区全长序列及UMI序列的产物；进一步的，根据是否带有UMI序列和步骤S3中上下游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，包括步骤：/nS1、获取骨髓或外周血样本细胞总mRNA，利用TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录，获取含有mRNA 5'端全部序列的cDNA分子；/nS2、结合以cDNA分子3'端通用序列为上游引物、基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物进行第一次PCR反应，且所述上游引物引入UMI序列；/nS3、取纯化后的第一次PCR产物作为模板，并以其两端的通用序列作为上下游引物进行第二次PCR反应，经过两轮PCR后获得包含TCR/BCR可变区CDR3全长序列及UMI序列的产物；/nS4、连接测序平台的接头序列于步骤S3获取的产物上，获得最终上机文库分子，进行测序；/nS5、根据测序质量值对测试序列进行过滤，进行过滤后数据的UMI自身校正，并根据UMI构建一致性序列；/nS6、一对一致性序列组装得到的序列即为一个克隆，对成对的一致性序列进行组装获得一个以上的克隆；/nS7、对获得的克隆进行比对分析，将相同的克隆归类为一个克隆型，统计每个克隆型对应的克隆数目；并对鉴定的克隆型注释，鉴定出V(D)J组合和CDR3序列；/nS8、结合步骤S7获取的数据进行样本淋巴细胞或浆细胞的序列、表征分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
S1、获取骨髓或外周血样本细胞总mRNA，利用TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录，获取含有mRNA5'端全部序列的cDNA分子；
S2、结合以cDNA分子3'端通用序列为上游引物、基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物进行第一次PCR反应，且所述上游引物引入UMI序列；
S3、取纯化后的第一次PCR产物作为模板，并以其两端的通用序列作为上下游引物进行第二次PCR反应，经过两轮PCR后获得包含TCR/BCR可变区CDR3全长序列及UMI序列的产物；
S4、连接测序平台的接头序列于步骤S3获取的产物上，获得最终上机文库分子，进行测序；
S5、根据测序质量值对测试序列进行过滤，进行过滤后数据的UMI自身校正，并根据UMI构建一致性序列；
S6、一对一致性序列组装得到的序列即为一个克隆，对成对的一致性序列进行组装获得一个以上的克隆；
S7、对获得的克隆进行比对分析，将相同的克隆归类为一个克隆型，统计每个克隆型对应的克隆数目；并对鉴定的克隆型注释，鉴定出V(D)J组合和CDR3序列；
S8、结合步骤S7获取的数据进行样本淋巴细胞或浆细胞的序列、表征分析。


2.根据权利要求1所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，步骤S5中数据的UMI自身校正以及构建一致性序列的步骤具体包括：
S51、对UMI进行聚类，校正UMI的自身错误；
S52、在校正过的UMI类群里，对UMI相同的序列进行比对，校正序列的碱基错误，构建一条一致性序列。


3.根据权利要求1所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，步骤S1中使用MMLVRT逆转录酶进行逆转录，并在逆转录至RNA分子5’末端时在产生的cDNA分子3’端加上若干“C”碱基，利用锁核酸修饰的模板转换引物与所加的若干C碱基配对产生延伸模板，使所得cDNA分子含有mRNA5'...

【专利技术属性】
技术研发人员：王夏，范文涛，王勇斯，温韵洁，
申请(专利权)人：广州华银健康医疗集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44