一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用。本发明专利技术提供了一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物。本发明专利技术提供的成套引物，由序列1‑序列78所示的引物组成。本发明专利技术建立的一种针对39种临床常见耐药基因的扩增子测序检测分析方法。该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于临床和畜牧养殖业中多种耐药基因的流行和差异分析。

【技术实现步骤摘要】
一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用
本专利技术属于微生物基因高通量测序
，具体涉及一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用。
技术介绍
宏基因组学(Metagenomics)，又称微生物环境基因组学、元基因组学。通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用宏基因组测序对微生物进行高通量测序，分析环境样品中的全部微生物组成、微生物多样性及其相应功能，进而探究微生物与环境、微生物及宿主之间的关联。宏基因组学在微生物组学的基础上发展而来的，不依赖于微生物的分离培养，可用于研究难培养或不可培养的微生物中的天然产物和处于沉默状态的天然产物，极大地提高了宏基因组样品中微生物资源的利用程度。通过对宏基因组样品进行深度测序分析，可以揭示或者评估环境中真实的物种多样性和遗传多样性，也可用于新型微生物活性物质(或新基因)的发现。目前，宏基因组学研究主要包括全基因组测序和靶向重测序两种手段。与全基因组测序(WGS)不同，靶向重测序技术是直接对样品中感兴趣的基因组区域进行分离、富集和测序。该方法更加地经济和高效，且具有更高的灵敏度，检测限可可低至0.1％。此外，靶向重测序地后续分析速度相对于WGS跨越性的提升。例如，宏基因组中，外显子仅占1％左右，却包含了却大部分已知突变，将外显子区域分离出后后进行单独测序，在后续的分析工作中，能降低99％的工作量，极大程度上简化了分析过程、加快了分析速度。目前，IonAmpliSeq技术是全球公认的靶向新一代测序(NGS)金标准，是一种基于扩增子的富集方法。其是最快、最简单、且最具可扩展性的NGS解决方案，目前还没有相应的替代品。目前IonAmpliSeq技术主要针对16SrDNA分析、遗传突变和疾病筛查等领域，目前尚未由针对抗生素耐药基因的相关设计。2019年联合国发布的一份报告显示，抗生素耐药性问题日益严重，如不利己采取应对措施，抗生素闹妖行疾病造成的死亡将会快速增加。到2050年，抗生素耐药性疾病每年可能造成1000万人死亡，对经济的破环相当于2008年的金融危机。近年来，革兰氏阳性细菌对各类抗生素的耐药情况日益增长，给临床上感染性疾病的治疗造成了极大地困难。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)是目前院内感染的重要病原菌之一，其治疗手段十分有限。对于宏基因组样品中耐药基因的测序和分析，能够更好的对环境中耐药基因的流行传播、遗传突变等进行分析，为临床上的疾病诊断和治疗提供一定的依据。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物。本专利技术提供的成套引物，由序列1-序列78所示的引物组成。上述成套引物由引物组1和引物组2组成；所述引物组1由序列1至序列44所示的引物组成；所述引物组2由序列45至序列78所示的引物组成。本专利技术另一个目的是提供一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的多重PCR试剂。本专利技术提供的多重PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；所述PCR试剂1包括权利要求2所述中的引物组1，所述PCR试剂2包括权利要求2所述中的引物组2。上述多重PCR试剂中，所述引物组1中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度均为400nMol/L；所述引物组2中的各条引物在所述PCR试剂2中的浓度均为400nMol/L。本专利技术还有一个目的是提供一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的多重PCR试剂。上述的引物组或上述的多重PCR试剂或上述的试剂盒在如下1)-3)中至少一种或者具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用也是本专利技术保护的范围：1)构建革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序文库；2)革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序；3)检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。本专利技术还提供了如下方法：本专利技术提供了一种检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因的方法，包括如下步骤：1)用上述多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。本专利技术提供了一种对待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因进行测序的方法，包括如下步骤：1)用上述的多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。上述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。本专利技术设计了一套引物组合，由引物池1和引物池2构成，共包含39对引物，每对引物对应的扩增子片段大小范围是125-275bp，能够高效、特异地对耐药基因进行靶向扩增。本专利技术基于IonAmpliseq技术的高通量扩增子靶向测序panel，针对宏基因组DNA中的特定耐药基因进行靶向测序，进而分析环境中耐药基因的分布和遗传进化，将抗生素耐药基因与环境、抗生素耐药基因与宿主关联起来。本专利技术建立的一种针对39种临床常见耐药基因的扩增子测序检测分析方法。该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于临床和畜牧养殖业中多种耐药基因的流行和差异分析。附图说明图1为高通量扩增子简易测序流程图。图2为扩增子测序文库构建原理图(参考IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0说明书)。图3为抗生素耐药基因设计分布图。图4为样品所构建文库Ampliseq检测结果。图5为6例样品宏基因组测序与Ampliseq基因检出数对比。图6为16例样品宏基因组测序与Ampliseq基因配对reads数对比。图7为6例样品抗生素耐药基因分析图。图8为6例样品宏基因组测序和宏基因组测序的比较。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下的实施例便于更本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物，由序列1-序列78所示的引物组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物，由序列1-序列78所示的引物组成。


2.根据权利要求1中所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物由引物组1和引物组2组成；
所述引物组1由序列1至序列44所示的引物组成；
所述引物组2由序列45至序列78所示的引物组成。


3.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的多重PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；
所述PCR试剂1包括权利要求2所述中的引物组1，
所述PCR试剂2包括权利要求2所述中的引物组2。


4.根据权利要求3所述的多重PCR试剂，其特征在于：所述引物组1中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度均为400nMol/L；
所述引物组2中的各条引物在所述PCR试剂2中的浓度均为400nMol/L。


5.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3或4所述的多重PCR试剂。


6.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3或4所述的多重PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在如下1)-3)中至少一种或者具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
1)构建革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序文库；
2)革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序；
3)检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。


7.一种检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因的方法，包括如下步骤：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少林，李一鸣，沈张奇，沈建忠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11