一种超高通量单细胞测序方法技术

本发明专利技术公开了一种超高通量单细胞测序方法，本发明专利技术超高通量单细胞测序方法通过分子标记微珠、反转录序列、桥连引物的使用，先使用反转录序列对细胞内进行一次细胞内反转录，再将经细胞内反转录后的细胞通过微孔板技术或微流控技术使一个分子标记微珠与一个或多个细胞处于分隔的空间中，并在裂解液作用下裂解细胞，反转录后得到的序列在桥连引物的帮助下与分子标记微珠上的分子标记序列连接，并通过PCR扩增获得大量序列，构建获得cDNA测序文库，然后进行高通量测序，一次测序便可以获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。大大提高了单细胞测序的通量。

【技术实现步骤摘要】
一种超高通量单细胞测序方法
本专利技术涉及单细胞测序
，特别是涉及一种超高通量单细胞测序方法。
技术介绍
自2009年汤富酬提出单细胞测序技术以来，单细胞高通量测序平台就如雨后春笋般不断涌现，例如以微流控为主的Drop-seq(Macosko,E.Z.,etal.,HighlyParallelGenome-wideExpressionProfilingofIndividualCellsUsingNanoliterDroplets.Cell,2015.161(5):p.1202-1214.)和inDrop-seq(Klein,AllonM.,etal.,DropletBarcodingforSingle-CellTranscriptomicsAppliedtoEmbryonicStemCells.Cell,2015.161(5):p.1187-1201.)平台，以微孔板为主的Microwell-seq(Han,X.,etal.,MappingtheMouseCellAtlasbyMicrowell-Seq.Cell,2018.173(5):p.1307.)和Seq-well(Gierahn,T.M.,etal.,Seq-Well:portable,low-costRNAsequencingofsinglecellsathighthroughput.NatMethods,2017.14(4):p.395-398.)平台以及常见的商用平台10×Gennomics。然而，以微孔板为例，当细胞投入量达到一定程度时，容易出现一个微孔中含有两个甚至更多细胞的情况出现，导致细胞与细胞间转录本的污染。为了避免这种现象的产生，通过分析发现当微孔板中细胞的落孔率约为微孔板总孔数的1/10时，可实现每个微珠仅捕获一个细胞。但这样会导致大量的液滴或者微孔仅仅只有空微珠而没有细胞，大大降低了实验的效率，增加了实验成本，导致这些平台单次实验的细胞通量只能以万为单位。然而，以小鼠和人为例，单个物种个体的细胞总量超过万亿，当下平台通量远远达不到测序的要求，测序通量的不足容易丢失大量的生物信息，因此提高单次测序的通量显得尤为重要。近年来以单个细胞为独立反应体系的超高通量技术也在不断发展，例如sci-RNA-seq([1]Cao,J.,etal.,Comprehensivesingle-celltranscriptionalprofilingofamulticellularorganism.Science,2017.357(6352):p.661-667.[2]Cao,J.,etal.,Thesingle-celltranscriptionallandscapeofmammalianorganogenesis.Nature,2019.566(7745):p.496-502.)和SPLiT-seq(Rosenberg,A.B.,etal.,Single-cellprofilingofthedevelopingmousebrainandspinalcordwithsplit-poolbarcoding.Science,2018.360(6385):p.176-182.)，他们首先将新鲜细胞固定打孔，利用反转录给每一个细胞带上一轮独有的分子标记，随后利用split-pool再给细胞带上不同的分子标记，最终通过分子标记的多重组合使得每一个细胞中的转录本带上独有的分子标记，大大提升了单次实验的通量。但由于这些方法是基于细胞体内的连接反应，存在反应效率低、细胞与细胞之间的转录本易泄露导致污染率较高等问题，降低了方法的实用性。2019年12月奥地利科学院分子医学研究中心的Paul等(Datlinger,P.,etal.,Ultra-highthroughputsingle-cellRNAsequencingbycombinatorialfluidicindexing.BioRxiv,2019.)利用反转录给固定的细胞带上一轮含有96/384种的分子标记后，结合微流控的方法将单细胞测序的通量提高了15倍。但以微流控为基础的测序平台细胞并不是平行进行实验的，批次效应问题比较显著，且存在设备昂贵、不易携带、测序成本高等缺点。
技术实现思路
本专利技术提供了一种超高通量单细胞测序方法，该单细胞测序方法能够一次性获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。一种超高通量单细胞测序方法，包括以下步骤：(1)准备如下试剂：a)分子标记微珠，所述分子标记微珠包括微珠本体和耦联的分子标记序列，该分子标记序列包括顺序排列的：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；第一细胞标签序列；第一搭桥序列；b)反转录序列，用于细胞内反转录，所述反转录序列包括顺序排列的：第二搭桥序列；第二细胞标签序列，与第一细胞标签序列配合组成细胞标签序列，所述细胞标签序列用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA取自的细胞；分子标签序列，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA；多聚T尾，用于与细胞中带有poly-A序列的mRNA互补配对；c)桥连引物，用于将上述a)中的标记序列与b)中的反转录序列进行连接，所述桥连引物两端具有分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对的序列；(2)取待测序的细胞样品，加入反转录序列进行细胞内反转录，使反转录序列的多聚T尾端连上将细胞内mRNA序列反转录后得到的cDNA序列，获得反转录序列-cDNA序列；(3)将步骤(2)经细胞内反转录后的细胞通过微孔板技术或微流控技术使一个分子标记微珠与一个或多个细胞处于分隔的空间中，并在裂解液作用下裂解细胞，孵育，通过桥连引物分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对，然后使用连接酶连接，使第一搭桥序列和第二搭桥序列连接获得与微珠耦联的分子标记序列-反转录序列-cDNA序列；(4)收集耦联有分子标记序列-反转录序列-cDNA序列的微珠，进行PCR扩增获得带有第一细胞标签序列、第二细胞标签序列和分子标签序列的cDNA序列；(5)将步骤(4)获得的产物构建cDNA测序文库，然后进行高通量测序，获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。通过将细胞标签序列分为第一细胞标签序列和第二细胞标签序列，第二细胞标签序列以反转录序列的形式在细胞内反转录时在各mRNA的反转录序列中引入，从而在出现一个分子标记微珠结合了多个细胞的情况下，能够通过这段第二细胞标签序列来区分开，否者，仅依靠分子标记微珠上的第一细胞标签序列，就无法区分结合同一分子标记微珠的多个细胞来源的序列。现有技术中，为了避免一个分子标记微珠结合多个细胞，需要严格控制条件，比如，将实验的微孔板上的微孔尽量制备成只容纳一个分子标记微珠和一个细胞的大小(这种情况下，分子标记微珠和细胞的相对大小不宜过大，不然，不容易实现一个分子标记微珠结合一个细胞)，同时需要控制细胞的落孔率在较低水平，以便细胞足够分散开，但还是无法避免出现一个分子标记微珠结合多个细胞的情况，而最本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高通量单细胞测序方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)准备如下试剂：/na)分子标记微珠，所述分子标记微珠包括微珠本体和耦联的分子标记序列，该分子标记序列包括顺序排列的：/n通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；/n第一细胞标签序列；/n第一搭桥序列；/nb)反转录序列，用于细胞内反转录，所述反转录序列包括顺序排列的：/n第二搭桥序列；/n第二细胞标签序列，与第一细胞标签序列配合组成细胞标签序列，所述细胞标签序列用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA取自的细胞；/n分子标签序列，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA；/n多聚T尾，用于与细胞中带有poly-A序列的mRNA互补配对；/nc)桥连引物，用于将上述a)中的标记序列与b)中的反转录序列进行连接，所述桥连引物两端具有分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对的序列；/n(2)取待测序的细胞样品，加入反转录序列进行细胞内反转录，使反转录序列的多聚T尾端连上将细胞内mRNA序列反转录后得到的cDNA序列，获得反转录序列-cDNA序列；/n(3)将步骤(2)经细胞内反转录后的细胞通过微孔板技术或微流控技术使一个分子标记微珠与一个或多个细胞处于分隔的空间中，并在裂解液作用下裂解细胞，孵育，通过桥连引物分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对，然后使用连接酶连接，使第一搭桥序列和第二搭桥序列连接获得与微珠耦联的分子标记序列-反转录序列-cDNA序列；/n(4)收集耦联有分子标记序列-反转录序列-cDNA序列的微珠，进行PCR扩增获得带有第一细胞标签序列、第二细胞标签序列和分子标签序列的cDNA序列；/n(5)将步骤(4)获得的产物构建cDNA测序文库，然后进行高通量测序，获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。/n...

【技术特征摘要】
1.一种超高通量单细胞测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备如下试剂：
a)分子标记微珠，所述分子标记微珠包括微珠本体和耦联的分子标记序列，该分子标记序列包括顺序排列的：
通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；
第一细胞标签序列；
第一搭桥序列；
b)反转录序列，用于细胞内反转录，所述反转录序列包括顺序排列的：
第二搭桥序列；
第二细胞标签序列，与第一细胞标签序列配合组成细胞标签序列，所述细胞标签序列用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA取自的细胞；
分子标签序列，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA；
多聚T尾，用于与细胞中带有poly-A序列的mRNA互补配对；
c)桥连引物，用于将上述a)中的标记序列与b)中的反转录序列进行连接，所述桥连引物两端具有分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对的序列；
(2)取待测序的细胞样品，加入反转录序列进行细胞内反转录，使反转录序列的多聚T尾端连上将细胞内mRNA序列反转录后得到的cDNA序列，获得反转录序列-cDNA序列；
(3)将步骤(2)经细胞内反转录后的细胞通过微孔板技术或微流控技术使一个分子标记微珠与一个或多个细胞处于分隔的空间中，并在裂解液作用下裂解细胞，孵育，通过桥连引物分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对，然后使用连接酶连接，使第一搭桥序列和第二搭桥序列连接获得与微珠耦联的分子标记序列-反转录序列-cDNA序列；
(4)收集耦联有分子标记序列-反转录序列-cDNA序列的微珠，进行PCR扩增获得带有第一细胞标签序列、第二细胞标签序列和分子标签序列的cDNA序列；
(5)将步骤(4)获得的产物构建cDNA测序文库，然后进行高通量测序，获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。


2.如权利要求1所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述微珠与分子标记序列耦联方式为：分子标记序列5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基，微珠表面修饰有羧基，通过羧基与氨基缩合耦联。


3.如权利要求1所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标签序列至少部分为随机合成的随机序列。


4.如权利要求3所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述第一细胞标签序列包括多个特异性片段，所述第二细胞标签序列包括至少一个特异性片段，不同位置的特异性片段选自相同的或不同的特异性片段库，所述第一细胞标签序列和第二细胞标签序列利用所述特异性片段的排列组合方式不同标识细胞。


5.如权利要求4所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标记微珠的制备方法包括以下步骤：
(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭国骥，廖原，陈海德，韩晓平，王晶晶，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33