【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法
本专利技术涉及藻华种检测
,更具体的说,它涉及基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法。
技术介绍
由于工业的加速与全球一体化进程,自20世纪70年代之后,环境污染与气候变化,特别是营养盐、污染物的排放与海上船运量的激增所引起的船舶压舱水在世界范围的移动等因素都导致了有害藻华发生频度的增加、并向高纬度发展以及全世界范围的扩散。有害藻华在全球范围内呈现频繁化、长期化、有毒化与灾害化。我国海域中东海海域也深受有害藻华的问题,是我国沿海居民健康、水产经济受影响最严重的区域。东海原甲藻、海洋原甲藻、米氏凯轮藻、短凯轮藻、塔玛亚历山大藻、锥状施克里普藻、底刺膝沟藻、夜光藻、中肋骨条藻、尖刺拟菱形藻等是我国东海区域常见的有害藻华爆发原因种。其中,以东海原甲藻和米氏凯轮藻造成的藻华为主。2005年爆发于浙江沿海的米氏凯伦藻藻华,给渔民造成的经济损失高达19.7亿元。在中国东海海域有害藻华爆发频繁的原因种中,原甲藻属与鳍藻属等藻类能够产生腹泻性贝类毒素,且引发了中毒事件。但是,由于有害藻华原因种个体微小,低密度时通过显微镜镜检较难检测到或难以进行准确鉴定,而当达到可检测的浓度时,或已造成渔业灾害或中毒事件发生。而且近来科研人员发现尽管是同一藻种,也有产毒与不产毒之分。诸多通过荧光定量PCR(qPCR)与高通量测序方法对浮游植物种群及有害藻华原因种以及基因型研究结果表明,利用分子检测技术对浮游植物种群与有害藻华原因种进行检测具有快速、准确、灵敏度高的优点。然而,由于浮游植物特别是甲藻 ...
【技术保护点】
1.基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法,其特征在于,具体包括如下步骤:/n101)筛选标准株系步骤:从相应海区采集目标有害藻华水样,用毛细管分离进行分离纯化并在控制条件下培养,对藻株进行形态学分析确认其形态分类学地位;其中通过从GenBank数据库检索、下载相应亲缘关系的物种信息,从分子进化分析角度以确定采集到的藻华水样的分类学地位;/n102)基因信息采集步骤:扩增步骤101)采集到的藻华水样的rDNA序列,进行同源检索和比对分析,并利用其高变区和保守区来分别进行种特异性和通用引物的设计和筛选;/n103)建立定量标准步骤:利用相应海区分离得到纯培养目标藻株进行基因组DNA的提取和定量分析,建立目标藻株细胞数量和核酸浓度的关系;用核酸进行qPCR,建立核酸浓度与Ct值的关系;并进一步绘制目标藻株细胞浓度与Ct值的标准曲线,求得定量回归曲线;从相应海区的有害藻华爆发海区采集现场水样,利用实验室优化的检测技术对其中的有害藻华藻进行qPCR定量分析,同时对样品中的目标有害藻华藻进行镜检计数,比较两种检测方法的差异性以及相关性,建立镜检计数和qPCR计数之间的回归关系,以此建立定量检 ...
【技术特征摘要】
1.基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
101)筛选标准株系步骤:从相应海区采集目标有害藻华水样,用毛细管分离进行分离纯化并在控制条件下培养,对藻株进行形态学分析确认其形态分类学地位;其中通过从GenBank数据库检索、下载相应亲缘关系的物种信息,从分子进化分析角度以确定采集到的藻华水样的分类学地位;
102)基因信息采集步骤:扩增步骤101)采集到的藻华水样的rDNA序列,进行同源检索和比对分析,并利用其高变区和保守区来分别进行种特异性和通用引物的设计和筛选;
103)建立定量标准步骤:利用相应海区分离得到纯培养目标藻株进行基因组DNA的提取和定量分析,建立目标藻株细胞数量和核酸浓度的关系;用核酸进行qPCR,建立核酸浓度与Ct值的关系;并进一步绘制目标藻株细胞浓度与Ct值的标准曲线,求得定量回归曲线;从相应海区的有害藻华爆发海区采集现场水样,利用实验室优化的检测技术对其中的有害藻华藻进行qPCR定量分析,同时对样品中的目标有害藻华藻进行镜检计数,比较两种检测方法的差异性以及相关性,建立镜检计数和qPCR计数之间的回归关系,以此建立定量检测标准;
104)高通量检测步骤:通过对步骤102)中藻华水样的rDNA序列中的多个通用区段的比较测试,比对选择不同生物信息学数据库,选取可以得到目标藻的种类最多的靶基因的测序区段与生物信息学数据库,从而反映现场样品有害藻类类群与藻类的相对丰度;
105)判定步骤:利用步骤103)建立好的定量检测标准,拟合经步骤104)获得的高通量分析结果,从而实现高通量测序的可定量化。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法,其特征在于:rDNA序列包括SSUrDNA、LSUrDNA和ITS区段。
3.根据权利要求2所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法,其特征在于:rDNA扩增测序得到序列后,进...
【专利技术属性】
技术研发人员:王鹏斌,胡家荣,郭若玉,陆斗定,戴鑫烽,
申请(专利权)人:自然资源部第二海洋研究所,
类型:发明
国别省市:浙江;33
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