基于qPCR检测肺小结节甲基化的核酸组合物、试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体地，本发明专利技术涉及一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物、检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法、试剂盒。本发明专利技术提供的检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒，其包括核酸组合物，所述核酸组合物包括引物组合物，利用所述试剂盒，通过qPCR联合检测p16INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因或RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的甲基化水平，提高了检测的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
基于qPCR检测肺小结节甲基化的核酸组合物、试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种用于检测非小细胞肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、检测非小细胞肺癌相关基因甲基化水平的方法、试剂盒。
技术介绍
DNA甲基化是哺乳动物中深入研究的表观遗传修饰之一。在正常细胞中，它可以确保基因表达的适当调节和稳定的基因沉默。DNA甲基化与癌症的发生密切相关。尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且多发生在癌前或者癌症早期阶段，因而有望成为癌症早期诊断的理想标志物。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80％，已成为世界上导致癌症死亡的主要原因。DNA甲基化异常的基因与癌症的诊断，治疗的预测和预后有关，而DNA甲基化异常出现在许多癌症类型的早期阶段。此外，在不同类型的样品(例如血浆，尿液，精液和粪便)中发现了异常甲基化的DNA，这表明DNA甲基化有可能成为非侵入性诊断生物标记物，这可能有助于NSCLC的早期诊断。现有的肺癌DNA甲基化检测试剂盒，选用SHOX2、RASSF1A基因研发了甲基化DNA检测试剂盒。针对肺泡灌洗液样本，结合亚硫酸盐修饰和Taqman探针两种技术，在实时荧光PCR平台实现样本甲基化DNA特异检测。研究结果显示，肺癌和非肺癌对照的患者肺泡灌洗细胞中SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测具有明显的差异，两基因联合检测对肺癌辅助诊断的灵敏度和特异性可分别达到71.5-83.2％和90-97.4％。但该试剂盒的灵敏度不高，导致检测结果不准确。因此，亟需开发一种具有较高灵敏度、检测结果准确的用于检测非小细胞肺癌的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒，其包括引物组合物，利用所述试剂盒，通过qPCR联合检测p16INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因或RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的甲基化水平，提高了检测的灵敏度和特异性。为此，本专利技术一方面提供了一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物。根据本专利技术的实施例，所述核酸组合物包括引物组合物，所述引物组合物包括：(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；以及任选地(4)用于检测p16INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。DNA甲基化异常的基因与癌症的诊断，治疗的预测和预后有关，而DNA甲基化异常出现在许多癌症类型的早期阶段。本专利技术的专利技术人选择血液中的基因甲基化与非小细胞肺癌NSCLC有显著性相关的基因，设计特异性的引物检测样品的甲基化水平。在癌症类型的早期阶段，对样本的DNA甲基化水平检测难度较大，而本申请的专利技术人创造性的发现，利用特异性的引物对，检测p16INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因或RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的DNA甲基化水平，提高了对早期非小细胞肺癌样本检测的灵敏度和特异性。根据本专利技术的实施例，所述第一引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。根据本专利技术的实施例，所述第二引物对包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物。根据本专利技术的实施例，所述第三引物对包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物。根据本专利技术的实施例，所述第四引物对包括SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的引物。本专利技术第二方面提供一种检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括：利用第一方面所述的核酸组合物，进行qPCR联合检测RASSF1A、MGMT和SHOX2基因以及任选地p16INK4a基因的DNA甲基化水平，以便获得非小细胞肺癌相关基因的DNA甲基化水平。本专利技术提供的检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的方法，利用qPCR检测血液中的基因甲基化与非小细胞肺癌NSCLC有显著性相关的基因的DNA甲基化水平，相比现有的检测方法，提升了检测结果灵敏度和特异性。本专利技术第三方面提供第一方面所述的核酸组合物在制备用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒中的用途。将本专利技术的核酸组合物应用于检测非小细胞肺癌相关基因甲基化的试剂盒中，利用该试剂盒能够准确检测临床样本非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平。p16INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因联合检测的灵敏度能达到85％，特异性90％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性；RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的联合检测能达到灵敏度能达到80％，特异性95％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性。本专利技术第四方面提供一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括第一方面所述的核酸组合物。利用本专利技术提供的试剂盒，能够准确检测临床样本非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平。p16INK4a、RASSF1A、MGMT和SHOX2四个基因联合检测的灵敏度能达到85％，特异性90％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性；RASSF1A、MGMT和SHOX2三个基因的联合检测能达到灵敏度能达到80％，特异性95％，在临床样本检测中有90％灵敏度和100％特异性。而现有的肺癌DNA甲基化检测试剂盒，对肺癌辅助诊断的灵敏度和特异性分别为71.5-83.2％和90-97.4％，因此，本专利技术提供的试剂盒显著提高了检测的灵敏度。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒进一步包括特异性检测内参基因的检测试剂。根据本专利技术的实施例，所述特异性检测内参基因的检测试剂包括检测β-Actin基因的引物。根据本专利技术的实施例，所述检测β-Actin基因的引物包括SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的引物。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。具体实施方式根据本专利技术的具体实施例，本专利技术提供的用于检测非小细胞肺癌相关基因甲基化的试剂盒，其包括：(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；以及任选地(4)用于检测p16INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。所述第一引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述第二引物对包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物；所述第三引物对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括引物组合物，所述引物组合物包括：/n(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；/n(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；/n(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；/n以及任选地(4)用于检测p16 INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测非小细胞肺癌相关基因DNA甲基化水平的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括引物组合物，所述引物组合物包括：
(1)用于检测RASSF1A基因的DNA甲基化的第一引物对；
(2)用于检测MGMT基因的DNA甲基化的第二引物对；
(3)用于检测SHOX2基因的DNA甲基化的第三引物对；
以及任选地(4)用于检测p16INK4a基因的DNA甲基化的第四引物对。


2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。


3.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第二引物对包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物。


4.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第三引物对包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物。


5.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第四引物对包括SEQIDNO:7和SEQIDNO:8...

【专利技术属性】
技术研发人员：濮悦，王涛，武艳丹，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33