【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的方法及应用。
技术介绍
1、目前文献和专利中对于年龄的评估常采用的方法是焦磷酸盐测序检测甲基化。焦磷酸测序技术(pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。公告号为cn104357561b的中国专利技术专利披露了《一种获得中国人群女性个体年龄的方法和系统》，其通过提取女性个体的dna，获得11个cpg位点的甲基化率，并对11个cpg位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，为推断中国人群女性个体年龄提供模型。公布号为cn109593862a的中国专利技术专利披露了《一种获得中国人群男性个体年龄的方法和系统》，其通过提取男性个体的dna，获得9个cpg位点的甲基化率，并对9个cpg位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，为推断中国人群男性个体年龄提供模型。公告号为cn110257494b的中国专利技术专利披露了《一种获得中国人群个体年龄的方法、系统及扩增检测体系》，其通过提取个体的dna，针对不同群体选择不同的cpg位点组合检测甲基化率，cpg位点组合数量在3-9个，并对各cpg位点组合与年龄进行回归分析，构建回归模型，提供了同时适用于中国人群男性和女性个体的年龄推断模型。三个专利中检测cpg位点甲基化率方法均为焦磷酸盐测序或质谱法。
2、另外其他比较常见的甲基化测定方法：(1)msp法(methylation-specific pcr，msp)，重亚硫酸盐处理基因
3、上述各种技术都可以量化dna甲基化，但是仍然具有一些缺陷，例如，对于年龄的评估常采用的焦磷酸盐测序技术，是一种新型的酶联级联测序技术，其适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与sanger dna测序法相媲美，但从成本上来讲，sanger测序法的成本较焦磷酸测序技术更低，对于样本通量比较低的情况下选择sanger测序法更合适。
4、msp法步骤简单，但对引物设计的要求较高，容易出现pcr假阳性，影响实验结果分析。
5、bsp法可明确样本待测区段每个cg位点的甲基化程度，但实验方法步骤繁琐，需要进行亚硫酸氢盐处理、pcr片段的克隆、重组载体的构建、阳性克隆的鉴定和dna测序等复杂的过程，耗时长且价格高。
6、高分辨率熔解曲线法，检测方法高通量，但是无法明确每个cg位点的甲基化程度。
7、目前仍然缺少一种即快速简单又精准的方法来确定基因中cpg位点的dna甲基化状态。
技术实现思路
1、本专利技术的目的开发是一种简单、快速、经济且准确度高的技术来确定特定基因的甲基化状态，用于年龄评估或其他需要快速量化甲基化模式的应用中。
2、一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的方法，首先提取个体dna，根据亚硫酸氢盐-pcr的原理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后利用针对目的基因设计的pcr引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物纯化后进行多重snapshot测序，获得cpg靶位点的甲基化率。
3、上述一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的方法的应用，用于年龄评估或其他需要快速量化甲基化模式中。
4、一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的年龄评估方法，首先提取个体dna，根据亚硫酸氢盐-pcr的原理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后利用针对目的基因设计的pcr引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物纯化后进行多重snapshot测序，获得cpg靶位点的甲基化率，然后对cpg位点的甲基化率与个体年龄进行多元线性回归分析，分别建立了训练集和测试集，通过训练集建立回归分析模型，然后用测试集对回归模型进行验证。
5、作为优选，所述cpg靶位点选取五个，分别是elovl2-chr6:11044628、fhl2-chr2:105399282、klf14-chr7:130734355、c1orf132-chr1:207823681、trim59-chr3:160450189。
6、作为优选，通过构建多元线性回归模型的建立得到甲基化年龄计算的回归方程：age＝-19.2363+88.03672*βelovl2-chr6:11044628+109.691*βfhl2-chr2:105399282+43.57257*βklf14-chr7:130734355-43.8456*βc1orf132-chr1:207823681+46.56786*βtrim59-chr3:160450189；
7、其中βelovl2-chr6:11044628、βfhl2-chr2:105399282、βklf14-chr7:130734355、βc1orf132-chr1:207823681和βtrim59-chr3:160450189分别为对应cpg靶位点的甲基化率。
8、作为优选，cpg靶位点的甲基化率的获得方法，具体步骤包括：
9、s1.根据cpg靶位点的位置将位点附近的碱基序列转化成亚硫酸氢盐处理后的碱基序列；
10、s2.根据各基因转化后的序列设计pcr扩增引物；
11、s3.对样本dna进行亚硫酸氢盐转化，获得样本的ssdna；
12、s4.以样本的ssdna为模板，利用步骤s2中的pcr扩增引物进行扩增；
13、s5.根据各基因各位点转化后的序列设计sbe引物；
14、s6.以步骤s4的pcr扩增产物为模板，步骤s5的sbe引物作为测序引物，进行snapshot测序检测，得到甲基化率。
15、作为优选，五个cpg靶位点elovl2-chr6:11044628、fhl2-chr2:105399282、klf14-chr7:130734355、c1orf132-chr1:207823681、trim59-chr3:160450189对应的sbe引物如下：
16、elovl2-chr6:11044628(如seq id no.21所示)：
17、5’-tttttttttttttttttttttttttt本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的方法，其特征在于，首先提取个体DNA，根据亚硫酸氢盐-PCR的原理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后利用针对目的基因设计的PCR引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯化后进行多重SNaPshot测序，获得CpG靶位点的甲基化率。
2.根据权利要求1所述一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的方法，其特征在于，CpG靶位点的甲基化率的获得方法，具体步骤包括：
3.如权利要求1所述一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的方法的应用，其特征在于，用于年龄评估。
4.一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的年龄评估方法，其特征在于，首先提取个体DNA，根据亚硫酸氢盐-PCR的原理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后利用针对目的基因设计的PCR引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯化后进行多重SNaPshot测序，获得CpG靶位点的甲基化率，然后对CpG位点的甲基化率与个体年龄进行多元线性回归分析，分别建立了训
5.根据权利要求4所述一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的年龄评估方法，其特征在于，所述CpG靶位点选取五个，分别是ELOVL2-Chr6:11044628、FHL2-Chr2:105399282、KLF14-Chr7:130734355、C1orf132-Chr1:207823681、TRIM59-Chr3:160450189。
6.根据权利要求5所述一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的年龄评估方法，其特征在于，通过构建多元线性回归模型的建立得到甲基化年龄计算的回归方程：
7.根据权利要求5所述一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的年龄评估方法，其特征在于，CpG靶位点的甲基化率的获得方法，具体步骤包括：
8.根据权利要求7所述一种基于多重SNaPshot技术检测DNA甲基化的年龄评估方法，其特征在于，五个CpG靶位点ELOVL2-Chr6:11044628、FHL2-Chr2:105399282、KLF14-Chr7:130734355、C1orf132-Chr1:207823681、TRIM59-Chr3:160450189对应的SBE引物如下：
...【技术特征摘要】
1.一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的方法，其特征在于，首先提取个体dna，根据亚硫酸氢盐-pcr的原理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后利用针对目的基因设计的pcr引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物纯化后进行多重snapshot测序，获得cpg靶位点的甲基化率。
2.根据权利要求1所述一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的方法，其特征在于，cpg靶位点的甲基化率的获得方法，具体步骤包括：
3.如权利要求1所述一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的方法的应用，其特征在于，用于年龄评估。
4.一种基于多重snapshot技术检测dna甲基化的年龄评估方法，其特征在于，首先提取个体dna，根据亚硫酸氢盐-pcr的原理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后利用针对目的基因设计的pcr引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物纯化后进行多重snapshot测序，获得cpg靶位点的甲基化率，然后对cpg位点的甲基化率与个体年龄进行多元线性回归分析，分别建立了训练集和测试集，通过训练集建立回归分析模型，然后用测试集对回归模型进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫海婷，赵钟毓，任文静，王洋，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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