一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用。所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。使用本发明专利技术的参考品进行文库构建，并且分别使用用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上、下游引物组进行两轮特异性扩增，能够准确、高效地检测耳聋基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用。
技术介绍
听觉系统中传音、感音及其听觉传导通路中的听神经和各级中枢发生病变，引起听功能障碍，产生不同程度的听力减退，统称为耳聋。耳聋的病因复杂，遗传因素是导致耳聋的主要原因。遗传性耳聋根据其临床表型分为非综合征型耳聋(non-syndromichearingimpairment，NSHI)与综合征型耳聋(syndromichearingimpairment，SHI)。非综合征型耳聋最常见，占总数的70％。非综合性耳聋的遗传方式表现为：常染色体隐性遗传(约75％-80％)、常染色体显性遗传(约20％)、X-连锁(约2-5％)和线粒体母系遗传(约1％)。在这些遗传方式中，临床上已经明确了GJB2与SLC26A4基因突变是导致耳聋的第一位与第二位致病原因。传统的耳聋基因产前诊断主要通过羊膜腔穿刺术(简称羊穿)、绒毛穿刺术或脐带血穿刺术等有创操作获取胎儿细胞进行检测，为侵入性产前诊断。侵入性产前诊断虽然准确度高，但可能造成胎儿损伤、流产或宫内感染等风险，降低了产前诊断的依从性。有相关研究发现母体血液中存在着胎儿的游离DNA，同时，证明了游离DNA诊断遗传性疾病的可行性和实际性。因此，可以通过采集孕妇静脉血，利用高通量DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息，从而检测胎儿耳聋相关基因的信息。目前无创产前耳聋基因检测技术没有参考品，从而严重制约了相关产品研发和现有产品的质量控制。因此，本专利技术主要针对无创耳聋基因的检测技术，开发出一种应用于无创耳聋基因检测参考品的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种检测耳聋基因的参考品，能够根据胎儿DNA含量和耳聋基因位点的检测频率，获得母体和胎儿的基因型信息。本专利技术还提出一种上述参考品的制备方法。本专利技术还提出一种用于检测耳聋基因突变型与缺失型的引物组。本专利技术还提出一种检测胎儿耳聋基因的方法。本专利技术还提出一种上述参考品的应用。根据本专利技术的第一方面，提出了一种检测耳聋基因的参考品，所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA包括来源于耳聋基因纯合突变、杂合子和阴性母体组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸；所述片段化的胎儿基因组DNA包括来源于耳聋基因纯合突变、杂合子和阴性胎儿组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸。在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸；片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸。在本专利技术的一些实施方式中，所述耳聋基因突变位点为SLC26A4c.1174A>T位点突变。在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变；所述片段化的胎儿基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变。在本专利技术的一些实施方式中，片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小为150-200bp。在本专利技术的一些实施方式中，片段化的胎儿DNA的含量占参考品总量的5-30％(v/v)。根据本专利技术的第二方面，提出了上述参考品的制备方法，所述制备方法如下步骤：S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA；S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化；S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品，其中，片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30％。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，所述母体样本的耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型或杂合突变；所述胎儿样本的耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型、纯合突变或杂合突变。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，样本为人体组织或外周血。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，样本为外周血。在本专利技术的一些实施方式，基因组DNA的样本类型分为样本1-样本6，其中，样本1为耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为纯合突变的胎儿组织样本，样本2为耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为杂合突变的胎儿组织样本，样本3为耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型的胎儿组织样本，样本4为耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为纯合突变的女性的外周血样本，样本5为耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为杂合突变的女性的外周血样本，样本6是耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型的女性的外周血样本。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组DNA提取采用基因组提取试剂盒QiagenDNeasyBlood&TissueKit。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组纯化采用试剂盒GenomicDNAClean&Concentrator-10进行纯化。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中，基因组DNA片段化采用超声波细胞破碎仪破碎细胞。在本专利技术的一些实施方式，所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功率70～80W，温度4～12℃，时间5～8min。在本专利技术的一些实施方式，所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功75W，温度10℃，时间6min。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S3中，所述参考品为R1-R7，所述参考品R1由90％样本4片段化的母体DNA(αα)和10％样本1片段化的胎儿DNA(bb)组成；所述参考品R2由90％样本4片段化的母体DNA(αα)和10％样本2片段化的胎儿DNA(Bb)组成；所述参考品R3由90％样本5片段化的母体DNA(Aa)和10％样本1片段化的胎儿DNA(bb)组成；所述参考品R4由90％样本5片段化的母体DNA(Aα)和10％样本2片段化的胎儿DNA(Bb)组成；所述参考品R5由90％样本5片段化的母体DNA(Aα)和10％样本3片段化的胎儿DNA(BB)组成；所述参考品R6由90％样本6片段化的母体DNA(AA)和10％样本2片段化的胎儿DNA(BB)组成；所述参考品R7由90％样本6片段化的母体DNA(AA)和10％样本3片段化的胎儿DNA(BB)组成。本专利技术第三方面提供一种用于检测耳聋基因突变型与缺失型的引物组，所述引物组包括如SEQIDNO.1～SEQIDNO.44所示的引物。在本专利技术的一些实施方式，所述的引物组包括引物分组1、引物分组2，其中，所述引物分组1由SEQIDNO.1～SEQIDNO.22混合配制而成，所述引物分组2为SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测耳聋基因的参考品，其特征在于，包括：片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测耳聋基因的参考品，其特征在于，包括：片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。


2.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，片段化的母体基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变；片段化的胎儿基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变。


3.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸；片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸；所述片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小分别为150-200bp。


4.根据权利要求1-3任一项所述的参考品，其特征在于，片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30％。


5.一种用于检测耳聋基因的参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下步骤：
S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA；
S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化；
S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品，其中，片段化...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁梦兮，黄文静，赵鑫，朱碧银，卜中鑫，曾华萍，王益民，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43