一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒技术

本发明专利技术实施例提供了一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒，涉及基因工程和分子生物学领域，本发明专利技术通过以目标序列为模板设计多组背靠背引物，并将多组所述背靠背引物分为两个或两个以上的引物池，使得每个引物池中相邻两组背靠背引物对应的目标区域之间的间隔距离≥所述引物池的个数

【技术实现步骤摘要】
一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因工程和分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]人类乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)最常见的病因之一。据统计，全球约有2.4亿人患有慢性HBV感染。每年由HBV感染引起的病毒性肝炎的发病和死亡的患者高达150万人。虽然预防乙肝病毒感染的疫苗现在已经广泛使用，但是目前还没有治疗慢性乙肝病毒的方法。
[0003]HBV整合和HCC的进展密切相关，相关统计显示，与HBV有关的肝癌病例中，大约有90％的病例发生了HBV的DNA整合。相比之下，在癌旁组织中较少发现HBV整合。HBV整合在肝癌发生中的作用已经被多种假说证实，包括形成持续的HBV基因表达模板，诱导染色体不稳定，以及破坏癌症相关的基因。HBV整合在宿主细胞基因组中随机发生，然而，重复整合位点的发现揭示了引起肝细胞克隆性扩张的特异性驱动基因，为肝癌的发生提供了可能的解释。HBV在HCC组织中的整合已被广泛研究。复发性整合事件经常发生在编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、混合谱系白血病4(MLL4)和细胞周期蛋白e1(CCNE1)的基因中。值得注意的是，纤维连接蛋白1(FN1)在癌旁组织中反复受到HBV整合的影响。
[0004]HBV属于肝病毒科(hepadnaviridae)，由包膜病毒组成，其不完整双链DNA基因组为3.2kb。HBV基因组包含四个部分重叠的开放阅读框(ORFs):C，编码核衣壳(core)蛋白(HBcAg)和分泌e抗原(HBeAg)；P，聚合酶蛋白(Pol)；S，包膜蛋白以及转录反式激活蛋白x。虽然HBV的突变可能发生在整个基因组中，但大多数以前发表的研究都集中在BCP区域(nt1751
‑
1769)，该区域主要受增强子Ⅱ(nt1636
‑
1744)的调控，并控制precore mRNA和pre Genome RNA的转录。A1762T/G1764A是目前研究最多的BCP区突变热点，这两个突变点已被证明是识别HBV感染的HCC高危人群的重要生物标志物。然而，在HBV全基因组范围内的变异情况还缺乏相关研究。
[0005]循环游离细胞DNA(cfDNA)已被证明是一种强有力的无创血液来源性的生物标志物，用于癌症早期检测、监测癌症发展和预测癌症预后。在健康人群中，血浆cfDNA主要来源于造血细胞。然而，在癌症患者中，它也可以在凋亡或坏死过程中从肿瘤细胞中释放出来，这被称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA占cfDNA的一部分，范围为0.1％
‑
90％，ctDNA的数量可以反映肿瘤患者的肿瘤发展情况。最近的研究发现，cfDNA携带的遗传和表观遗传信息在HCC中具有重要的诊断和预后价值。然而，HBV在HCC cfDNA中的整合/突变情况仍然未知。
[0006]全基因组测序(WGS)是实现同时检测cfDNA中的整合/突变的理想方式，2012年《Nature Genetic》的研究中用WGS的方法检测了81例HBV阳性肝癌患者中的HBV整合情况，共得到399个整合位点。随后作者从399个整合位点中随机选取了32个整合位点进行PCR验证，有82％的整合位点得到验证。WGS是一种检测全面，且方法简单的方法。但是WGS的成本
高昂，且产生的数据量大，对分析WGS数据的计算机资源要求高。这两个缺点限制了WGS在HBV整合和突变检测中的应用。
[0007]探针捕获也是一种可以用来检测HBV整合的方法。2016年《Nature Communication》的研究中使用探针捕获的方法检测了426例HCC样本，共得到4225个HBV整合位点，随后作者随机选取了180个整合位点进行PCR验证，其中有81.1％的位点验证成功。探针捕获也是一种能在碱基水平检测HBV整合的方法，但是如果要覆盖各种HBV亚型，需要设计大量的探针，极大增加了捕获成本。此外，捕获的探针模板只能参考HBV的基因组序列，而cfDNA中的目标序列是一部分人基因组一部分HBV基因组，捕获的效率也会受影响。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒。
[0010]本专利技术是这样实现的：
[0011]第一方面，本专利技术实施例提供了一种检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其包括：获取待测样本中的cfDNA，在所述cfDNA片段的两端添加带有标签的环化接头，并将添加环化接头的cfDNA片段环化；
[0012]以目标序列为模板设计多组背靠背引物，多组所述背靠背引物分别与所述目标序列上不同的目标区域互补，每组背靠背引物均包括前导链引物和后随链引物，所述前导链引物和所述后随链引物的扩增方向相反，且所述后随链引物与所述目标序列互补的区域位于所述前导链引物与所述目标序列互补的区域的上游；
[0013]将多组所述背靠背引物分为两个或两个以上的引物池，使得每个引物池中相邻两组背靠背引物对应的目标区域之间的间隔距离≥所述引物池的个数
ⅹ
(45～75)；
[0014]采用两个或两个以上的所述引物池分别单独地对环化后的cfDNA片段进行环化扩增，并对扩增后的产物进行测序分析。
[0015]第二方面，本专利技术实施例提供了一种引物的设计方法，应用于如前述实施例所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其包括以目标序列为模板设计多组背靠背引物，多组所述背靠背引物分别与所述目标序列上不同的目标区域互补，每组背靠背引物均包括前导链引物和后随链引物，所述前导链引物和所述后随链引物的扩增方向相反，且所述后随链引物与所述目标序列互补的区域位于所述前导链引物与所述目标序列互补的区域的上游；
[0016]将多组所述背靠背引物分为两个或两个以上的引物池，使得每个引物池中相邻两组背靠背引物对应的目标区域之间的间隔距离≥所述引物池的个数
ⅹ
(45～75)。
[0017]第三方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测目标序列整合和/或突变的试剂盒，其包括如前述实施例所述的引物的设计方法设计的引物组。
[0018]本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术实施例提供了一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒，基于上述引物设计原则，能够同时对目标序列(如病毒)的整合和突变进行高特异性的检测，为基因整合和基因突变的检测方法提供了新的思路。
Amplification and Resequencing Technology)，通过对外周血中游离的DNA片段进行标记，环化，扩增和测序，能够定量的分析外周血游离DNA片段所携带的突变。
[0036]本专利技术以cSMART技术为基础，对其进行改进，将多组背靠背引物分为两个或两个以上的引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，其包括：获取待测样本中的cfDNA，在cfDNA片段的两端添加带有标签的环化接头，并将添加环化接头的cfDNA片段环化；以目标序列为模板设计多组背靠背引物，多组所述背靠背引物分别与所述目标序列上不同的目标区域互补，每组背靠背引物均包括前导链引物和后随链引物，所述前导链引物和所述后随链引物的扩增方向相反，且所述后随链引物与所述目标序列互补的区域位于所述前导链引物与所述目标序列互补的区域的上游；将多组所述背靠背引物分为两个或两个以上的引物池，使得每个引物池中相邻两组背靠背引物对应的目标区域之间的间隔距离≥所述引物池的个数
ⅹ
(45～75)；采用两个或两个以上的所述引物池分别单独地对环化后的cfDNA片段进行环化扩增，并对扩增后的产物进行测序分析。2.根据权利要求1所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，所有背靠背引物对应的目标区域的总覆盖率占所述目标序列总长的50％以上；优选地，所述总覆盖率占所述目标序列总长的80％以上；优选地，当所述目标序列为具有多个亚型的序列时，每组所述背靠背引物中，所述前导链引物和/或所述后随链引物的条数≥2，以使该组背靠背引物能够对同一区域的不同亚型进行扩增检测。3.根据权利要求1所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，cfDNA片段环化的方法如下：在样本中添加辅助成环序列，以使添加有环化接头的cfDNA片段环化；所述环化接头包括有相互连接的标签序列和接头序列，当环化接头连接于cfDNA序列两端时，所述接头序列通过所述标签序列与cfDNA片段相连；所述辅助成环序列上具有能够分别与2段接头序列互补配对的第一结合区域和第二结合区域，当第一结合区域与所述第二结合区域分别与所述cfDNA片段两端的接头序列相连时，所述cfDNA片段成环状。4.根据权利要求1～3任一项所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，在环化扩增后，测序分析前，所述方法还包括对环化扩增产物两端添加测序接头；在所述测序分析中，序列的起止点和标签相同的多个扩增产物被认为是重复的，只进行一次计数；优选地，所述测序分析包括：去除扩增产物的测序接头后，根据序列之间的重叠部分将序列进行组装，随后根据引物的位置信息、标签以及环化接头，对组装的序列进行重构；将重构后的序列比对至参考序列和参考基因组的集合；基于对比信息，获得待测样本中初始cfDNA模板序列；优选地，在进行组装前，所述方法包括对扩增产物进行低质量reads过滤。5.根据权利要求4所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，当检测样本中目标序列的整合时，所述测序分析还包括：将所有初始cfDNA模板序列比对至所述参考序列和所述参考基因组的集合，并基于比对信息对cfDNA模板序列进行过滤：将初始cfDNA模板序列上能够比对至所述参考序列上的区域标记为第一区域，能够比对至所述参考基因组上的区域标记为第二区域；
只保留同时具有所述第一区域和所述第二区域且所述第一区域和所述第二区域的长度≥50bp的cfDNA模板序列，用于获取整合位点；优选地，对cfDNA模板序列进行过滤时，还包括基于比对信息进行筛选，只保留cigar信息为S/M的cfDNA模板序列，用于获取整合位点；优选地，所述方法还包括对检测获得的整合位点进行过滤，若一条cfDNA模板序列上的所述第一区域和所述第二区域在交界处存在重叠，则将该重叠的部分视为归属于第一区域，用于判断获取最终的整合位点。6.根据权利要求4所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，当检测目标序列的突变时，所述测序分析还包括：将所有初始cfDNA模板序列与所述参考序列进行比对，并基于对比结果和测序信息对检测得到的初始突变位点进行过滤：若初始突变位点的测序深度小于10
ⅹ
，则去除该位点，反之则保留；若初始突变位点的VAF为1且群体基因频率大于0.9，则去除该位点，反之则保留。7.根据权利要求4所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，所述目标序列为HBV，所述参考序列为HBV基因组序列，所述参考基因组为人类基因组序列。8.一种引物的设计方法，应用于如权利要求1～7任一项所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，其包括以目标序列为模板设计多组背靠背引物，多组所述背靠背引物分别与所述目标序列上不同的目标区域互补，每组背靠背引物均包括前导链引物和后随链引物，所述前导链引物和所述后随链引物的扩增方向相反，且所述后随链引物与所述目标序列互补的区域位于所述前导链引物与所述目标序列互补的区域的上游；将多组所述背靠背引物分为两个或两个以上的引物池，使得每个引物池中相邻两组背靠背引物对应的目标区域之间的间隔距离≥所述引物池的个数
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(45～75)。9.一种用于检测目标序列整合和/或突变的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求8所述的引物的设计方法设计的引物组。10.根据权利要求9所述的用于检测目标序列整合和/或突变的试剂盒，其特征在于，所述目标序列为HBV，所述引物池的个数为4个，包括引物池A、引物池B、引物池C和引物池D；所述引物池A包括14组引物：引物组A1，前导链引物的序列选自SEQ ID No.1～4中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.5～8中的至少一种；引物组A2，前导链引物的序列选自SEQ ID No.9～11中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.12；引物组A3，前导链引物的序列选自SEQ ID No.13～15中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.16～19中的至少一种；引物组A4，前导链引物的序列选自SEQ ID No.20～22中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.23～25中的至少一种；引物组A5，前导链引物的序列选自SEQ ID No.26～29中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.30～33中的至少一种；引物组A6，前导链引物的序列选自SEQ ID No.34～37中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.38～41中的至少一种；引物组A7，前导链引物的序列选自SEQ ID No.42～45中的至少一种，后随链引物的序
列选自SEQ ID No.46；引物组A8，前导链引物的序列选自SEQ ID No.47～50中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.51～53中的至少一种；引物组A9，前导链引物的序列选自SEQ ID No.54～57中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.58～60中的至少一种；引物组A10，前导链引物的序列选自SEQ ID No.61～64中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.65～68中的至少一种；引物组A11，前导链引物的序列选自SEQ ID No.69～71中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.72；引物组A12，前导链引物的序列选自SEQ ID No.73～77中的至少一种，后随链引物的序列选自SEQ ID No.78～81中的至少一种；引物组A13，前导链引...

【专利技术属性】
技术研发人员：茹兰兰，刘高京，王寅，白健，苏晓星，吴琳，
申请(专利权)人：福建和瑞基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：