一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，包括如下实验步骤：S1、细菌基因组DNA提取；S2、引物与探针设计；S3、目的片段PCR扩增；S4、PCR产物回收及纯化；S5、标准质粒的构建；S6、重组质粒鉴定；S7、MIRA体系的建立；S8、MIRA引物筛选；S9、灵敏度试验；S10、特异性试验；S11、重复性试验；S12、临床样本检测；本实验应用多酶恒温快速扩增技术分别针对沙门氏菌中invA基因，筛选合适的引物和探针，本实验建立的MIRA诊断技术方便快捷，便于规模化畜禽养殖场的快速大规模检测诊断，此种方法具有较高的特异性、高度的灵敏性、实验所需仪器简单便捷并且反应所需时间短，适合临床的紧急样本的快速检测诊断。的快速检测诊断。的快速检测诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体为一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法。

技术介绍

[0002]随着现代科技和经济水平的快速发展，人们对畜禽肉类的需求越来越大，因而促进了规模化的畜禽养殖场的诞生，在进行规模化畜禽养殖的时候，由于禽畜缺少必要的活动空间，容易导致病菌在禽畜之间进行传播，从而容易造成禽畜发生疾病的情况，沙门氏菌畜禽养殖生产中主要的致病性病原菌，近年来关于这种病原菌导致动物发病的报道较多，大多数与畜禽废弃物产生的环境污染有关。虽然对这些废弃物进行无害化处理，但病原菌感染导致畜禽发病的情况仍常发生。且近年来抗生素的使用，细菌耐药性增高，而传统的检测方法容易出现假阴性结果，所以建立快速、简便、特异、灵敏、低耗且适用的快速检测诊断致病微生物的方法十分有必要，传统的检测方法对禽畜进行检测的时候，由于禽畜的数量较多，传统的检测防止在对禽畜进行检测的时候，较为浪费时间，且不能快速的对禽畜进行检测，并且传统的检测方式，灵敏性较低，所需要的实验仪器较为复杂，不方便临床的紧急样本的快速检测诊断。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，解决了上述
技术介绍
中所存在的问题。
[0005](二)技术方案
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，包括如下实验步骤：
[0007]S1、细菌基因组DNA提取；
[0008]S2、引物与探针设计；
[0009]S3、目的片段PCR扩增；
[0010]S4、PCR产物回收及纯化；
[0011]S5、标准质粒的构建；
[0012]S6、重组质粒鉴定；
[0013]S7、MIRA(荧光型)体系的建立；
[0014]S8、MIRA(荧光型)引物筛选；
[0015]S9、灵敏度试验；
[0016]S10、特异性试验；
[0017]S11、重复性试验；
[0018]S12、临床样本检测。
[0019]优选的，所述步骤S1中，具体操作步骤如下：
[0020](1)、取备用的菌液5mL，10000rpm离心1min，留取沉淀物；
[0021](2)、在沉淀物中加入菌液：GA溶液＝25:1的GA溶液，使用振荡器悬浊溶液；
[0022](3)、在管中加入GA溶液：proteunase K溶液＝10:1的proteunase K溶液，吹打混匀；
[0023](4)、继续加入proteunase K溶液：GB溶液＝1：1的GB溶液，震荡混匀，在70℃水浴；
[0024](5)、锅中静放10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；
[0025](6)、再加入GB溶液：无水乙醇＝1:11的无水乙醇，震荡混匀要充分；
[0026](7)、将混匀的溶液(包括絮状物)加入到吸附柱
‑
收集管CB3中，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
[0027](8)、在吸附柱
‑
收集管CB3中加入无水乙醇：GD溶液＝11:25的GD溶液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体。
[0028](9)、在吸附柱
‑
收集管CB3中加入GD溶液：PW漂洗液＝5:6的PW漂洗液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
[0029](10)、重复上一步；
[0030](11)、吸附柱
‑
收集管CB3空管离心2min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；
[0031](12)、取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50
‑
200μL的TE溶液，12000rpm离心2min，收集得到试管中的液体。
[0032]优选的，所述步骤S2中，在GenBank中检索禽沙门氏菌的invA基因(GenBank ID：1254419)通过MEGLIGN软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在Primer Primer5的辅助下，设计invA基因特异性MIRA引物和探针，MIRA(荧光型)引物名称及引物序列如下：
[0033]YinvAF1：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGC；
[0034]YinvAF2：ATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
[0035]YinvAF3：ACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
[0036]YinvAF4：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGT；
[0037]YinvAF5：CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
[0038]YinvAF6：TGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
[0039]YinvAR1：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA；
[0040]YinvAR2：TAATACCAAAGGACACGACTTCATCGGAATA；
[0041]YinvAR3：GACTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGAT；
[0042]YinvAR4：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATT；
[0043]YinvAR5：CTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT；
[0044]YinvAR6：ACTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT。
[0045]优选的，所述步骤S3中，根据禽沙门氏菌invA基因片段大小为2065bp，在Primer Primer5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增，PCR全长引物名称及引物序列如下：
[0046]SinvA
‑
AllF：ATGCGGGCGAAACTTCTGGGA；
[0047]SinvA
‑
AllR：TTAAAATGTGTACTTAAGACCAGCA。
[0048]优选的，所述步骤S4中具体操作步骤如下：
[0049](1)、用干净的手术刀将琼脂糖凝胶电泳的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重；
[0050](2)、根据胶块的重量和浓度，按琼脂糖：Buffer B2＝1:(3
‑
6)的比例加入Buffer B2；
[0051](3)、将离心管置于50℃水浴锅中5
‑
10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
[0052](4)、在吸附柱中心加入融化好的琼脂糖，8000Xg离心30seC。倒掉废液，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：包括如下实验步骤：S1、细菌基因组DNA提取；S2、引物与探针设计；S3、目的片段PCR扩增；S4、PCR产物回收及纯化；S5、标准质粒的构建；S6、重组质粒鉴定；S7、MIRA体系的建立；S8、MIRA引物筛选；S9、灵敏度试验；S10、特异性试验；S11、重复性试验；S12、临床样本检测。2.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S1中，具体操作步骤如下：(1)、取备用的菌液5mL，10000rpm离心1min，留取沉淀物；(2)、在沉淀物中加入菌液：GA溶液＝25:1的GA溶液，使用振荡器悬浊溶液；(3)、在管中加入GA溶液：proteunase K溶液＝10:1的proteunase K溶液，吹打混匀；(4)、继续加入proteunase K溶液：GB溶液＝1：1的GB溶液，震荡混匀，在70℃水浴；(5)、锅中静放10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；(6)、再加入GB溶液：无水乙醇＝1:11的无水乙醇，震荡混匀要充分；(7)、将混匀的溶液包括絮状物加入到吸附柱
‑
收集管CB3中，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；(8)、在吸附柱
‑
收集管CB3中加入无水乙醇：GD溶液＝11:25的GD溶液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体。(9)、在吸附柱
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收集管CB3中加入GD溶液：PW漂洗液＝5:6的PW漂洗液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；(10)、重复上一步；(11)、吸附柱
‑
收集管CB3空管离心2min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；(12)、取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50
‑
200μL的TE溶液，12000rpm离心2min，收集得到试管中的液体。3.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S2中，在GenBank中检索禽沙门氏菌的invA基因通过MEGLIGN软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在Primer Primer5的辅助下，设计invA基因特异性MIRA引物和探针，MIRA引物名称及引物序列如下：YinvAF1：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGC；YinvAF2：ATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAF3：ACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；YinvAF4：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGT；YinvAF5：CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；YinvAF6：TGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；YinvAR1：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA；YinvAR2：TAATACCAAAGGACACGACTTCATCGGAATA；YinvAR3：GACTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGAT；YinvAR4：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATT；YinvAR5：CTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT；YinvAR6：ACTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT。4.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S3中，根据禽沙门氏菌invA基因片段大小为2065bp，在Primer Primer5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增，PCR全长引物名称及引物序列如下：SinvA
‑
AllF：ATGCGGGCGAAACTTCTGGGA；SinvA
‑
AllR：TTAAAATGTGTACTTAAGACCAGCA。5.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S4中具体操作步骤如下：(1)、用干净的手术刀将琼脂糖凝胶电泳的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重；(2)、根据胶块的重量和浓度，按琼脂糖：Buffer B2＝1:3
‑
6的比例加入Buffer B2；(3)、将离心管置于50℃水浴锅中5
‑
10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；(4)、在吸附柱中心加入融化好的琼脂糖，8000
×
g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；(5)、在吸附柱中心加入300μL Buffer B2，9000
×
g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；(6)、在吸附柱中心加入500μL加了无水乙醇的Wash Solution，9000
×
g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；(7)、重复步骤6一次；(8)、在离心机中放入空吸附柱和收集管，9000
×
g离心60seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；(9)、在吸附柱中心加入15
‑
40μL Elution Buffer，在常温下静置1
‑
2min，9000
×
g离心60seC，收集离心下来的液体于
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20℃的冰箱中保存。6.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S5操作如下：(1)、在微量离心管中配制pMD19
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T Vector：Insert DNA：灭菌水溶液＝1:5:4，全量为5μL；(2)、加入5μL的Solution I；(3)、16℃反应30分钟，室温也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，长片段PCR产物2kb以上进行DNA克隆时，连接反
应时间需延长至数小时；(4)、使用保存在
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【专利技术属性】
技术研发人员：邵颖，杨侃侃，祁钊，王成，涂健，宋祥军，姚臣，杨正庆，祖坤，赵俊，许成虎，周师义，
申请(专利权)人：安徽大自然种猪股份有限公司芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司安徽昌农农牧食品有限公司，
类型：发明
国别省市：