本发明专利技术公开了一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物和CYP2C19*17测序引物。本发明专利技术采用样本处理液A快速样本释放出DNA，并通过样本处理液B中氯化钙与十二烷基硫酸锂产生不溶性钙盐沉淀中和表面活性剂，同时不溶性钙盐沉淀和Chelex‑100双重吸附血红素等DNA抑制物，快速得到质量较高的DNA模板，DNA模板通过非对称多重PCR一管扩增三个基因位点，产生大量的生物素标记的单链DNA，生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤，简化了测序流程和时间。
【技术实现步骤摘要】
一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术涉及一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，属于药物基因组检测领域。
技术介绍
细胞色素P450，2C19(cytochromeP4502C19，CYP2C19)是人体中重要的药物代谢酶，参与多种药物的代谢，如抗血小板聚集药物氯吡格雷等。氯吡格雷是治疗急性冠状动脉综合征和经皮冠状动脉介入术后抗栓的基础药物，但4％～30％患者在治疗期间出现氯吡格雷疗效下降，甚至出现氯吡格雷抵抗。氯吡格雷为前体药，主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。CYP2C19有超过20多个位点突变，其中最常见的功能性缺失位点为CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)，以及一个常见的功能性获得位点CYP2C19*17(rs12248560，c.-806C>T)。CYP2C19酶有四种不同的代谢类型：超快代谢型(UM，*17/*17)；快代谢型(EM，*1/*1)；中间代谢型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)；慢代谢型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)。中国人中CYP2C19弱代谢者表型几乎均为CYP2C19*2和CYP2C19*3，常规剂量的氯吡格雷在慢代谢型患者中产生的活性代谢物减少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓风险增加。ELEVATE-TIMI56试验结果表明CYP2C19*2等位基因携带者血小板反应性显著高于非携带者，CYP2C19*2杂合子携带者达到非携带者75mg标准剂量的血小板反应性需要3倍每日维持剂量(225mg)；而CYP2C19*2纯合子患者，即使氯吡格雷剂量达到4倍标准剂量(300mg)，仍达不到最佳血小板抑制程度。2010年美国FDA修改的氯吡格雷说明书中黑框警示：CYP2C19基因型检测结果应作为医生调整治疗策略的参考。美国心脏病学学院/美国心脏学会(ACC/AHA)根据目前的多项临床试验的结果建议应用氯吡格雷而仍然发生心血管事件的患者，如果没有药物依从性方面的问题，应考虑增加氯吡格雷的剂量或应用其他药物，但需充分平衡缺血与出血风险。目前，对于CYP2C19基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；芯片法涉及基因特异扩增、杂交、检测等多个步骤，可进行高通量分析，但其成本较高，检测步骤复杂且对样本数量有一定的要求；高分辨率熔解曲线法步骤简单，不需要做扩增后处理，但其不含特异性荧光探针，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，操作方法简单，无需扩增后处理，但其引物设计难以最优化，检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法操作方法简单，无需扩增后处理，但其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测CYP2C19基因多态性的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以不对称PCR和焦磷酸检测为基础，获得一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：所述氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物、CYP2C19*17测序引物、阳性对照。优选的，CYP2C19*2测序引物如序列表SEQIDNO:1～3所示、CYP2C19*3测序引物如序列表SEQIDNO:4～6所示、CYP2C19*17测序引物如序列表SEQIDNO:7～9所示。具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：优选的，所述样本处理液A，包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、5-15％海藻糖、3～7mmol/LBSA、20-80mMTris-HCl、100mMNaCl，PH＝8.5-9.5。更优选的，所述样本处理液A，包括0.3％-0.5％十二烷基硫酸锂、0.2-0.4％曲拉通X-100、8-12mM甜菜碱、8-12％海藻糖、4～6mMBSA、50mMTris-HCl、100mMNaCl，PH＝9。优选的，所述的样本处理液B，包括1-3％Chelex-100、1-10％氯化钙。更优选的，所述样本处理液B，包括1.8-2.2％Chelex-100、3-5％氯化钙。优选的，所述的扩增反应液，包括CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物，还包括PCRBuffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻糖、无核酸酶水。更优选的，反应液各组分浓度分别为：CYP2C19*2前引物(1.2uM)，CYP2C19*2后引物(0.03uM)，CYP2C19*3前引物(1.5uM)，CYP2C19*3后引物(0.04uM)，CYP2C19*17前引物(1.2uM)，CYP2C19*17后引物(0.03uM)，PCRBuffer(1.5×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，dUTP(0.5mM)、UDG酶(1U)和无核酸酶水(将体系补充至20μL)。优选的，所述的阳性对照，包括浓度均为105copies的CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型、CYP2C19*17野生型、CYP2C19*2突变型、CYP2C19*3突变型和CYP2C19*17突变型6种质粒等比混合而成的混合物。本专利技术还公开了一种采用上述试剂盒的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：a.样本处理液A和EDTA抗凝全血或口腔拭子样本等比混合，室温静置5min，加入样本处理液B短暂离心后上清液作为DNA模板；b.将扩增反应液与5ul待测模板混合，采用非对称多重PCR扩增进行扩增；c.将反应产物进行焦磷酸测序；d.确定CYP2C19*2位点、CYP2C19*3位点和CYP2C19*17位点的基因型。优选的，所述的反应体积为25ul，扩增条件为：酶处理37℃3min；预变性95℃，5min；40个循环，95℃15s，60℃25s，72℃25s；最后延伸72℃4min。本专利技术还公开了一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒对CYP本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物和CYP2C19*17测序引物。/n
【技术特征摘要】
1.一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物和CYP2C19*17测序引物。
2.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19*2测序引物如序列表SEQIDNO:1～3所示、CYP2C19*3测序引物如序列表SEQIDNO:4～6所示、CYP2C19*17测序引物如序列表SEQIDNO:7～9所示。
3.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，阳性对照包括浓度均为105copies的CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型、CYP2C19*17野生型、CYP2C19*2突变型、CYP2C19*3突变型和CYP2C19*17突变型6种质粒等比混合而成的混合物。
4.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液A，包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、5-15％海藻糖、3～7mmol/LBSA、20-80mMTris-HCl和100mMNaCl，PH＝8.5-9.5。
5.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液B包括1-3％Chelex-100和1-10％氯化钙。
6.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括PCRBuffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶婷，刘丹，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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