本发明专利技术公开了一种他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测他汀类药物疗效相关基因SLCO1B1T521C和SLCO1B1A388G两个基因的多态性，试剂盒包括如下组分：SLCO1B1T521C扩增引物、SLCO1B1T521C测序引物、SLCO1B1A388G扩增引物、SLCO1B1A388G测序引物和阳性对照。本发明专利技术以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对汀类药物不良反应相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测SLCO1B1(T521C)、SLCO1B1(A388G)基因多态性，为临床汀类药物个性化用药给出基因角度的建议。因角度的建议。因角度的建议。
【技术实现步骤摘要】
一种他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
[0001]本专利技术涉及一种他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
技术介绍
[0002]根据我国流行病学调查，中国成人血脂异常总体患病率在2012年高达40.40％，较10年前呈大幅度上升，血清总胆固醇(TC)水平的升高将导致未来中国心血管病事件增加约920万。他汀类药物在ASCVD一级和二级预防中均能显著降低心血管事件风险，是防治此类疾病最为重要的药物，对抑制心脑血管疾病也有显著作用，但其不良反应具有明显的个体差异，在部分人群中，他汀类药物会引起肌肉毒性，严重者出现横纹肌溶解症。SLCO1B1*1b、*5、*15是常见的基因突变类型，其中*5、*15是他汀类药物主要不良反应“横纹肌溶解症”的独立决定因子。该突变基因携带者相比未突变者发生肌毒性的风险增加约20倍。服用他汀类药物前对该突变进行检测对发生肌毒性的预测和预防具有重要意义。
[0003]SLCO1B1基因521T>C位点位于12号基因外显子5，TT型为野生型，TC型为突变杂合子，CC型为突变纯合子。研究者发现521TC基因型在普伐他汀升高肾移植受体的HDL
‑
C的效果好于521TT，但521T>C多态性对普伐他汀降低TC和LDL
‑
C效果影响较小。研究发现SLCO1B1基因521T>C显著影响辛伐他汀酸的药动学参数，CC基因型个体辛伐他汀酸的AUC分别较CT和TT基因型个体高120％和221％。SLCO1B1基因521T＞C可明显降低转运阿托伐他汀的能力。SLCO1B1 521T＞C的突变降低了OATP1B1的转运功能，388A＞G的突变不影响其转运功能，但是两位点突变构成的单倍体GGCC基因型可显著降低OATP1B1的转运功能
[0004]目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。
技术实现思路
[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以多重RPA扩增和焦磷酸测序技术为基础检测基因多态性，获得一种他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒及方法及其检测方法和应用。
[0006]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
[0007]本专利技术的检测试剂盒针对SLCO1B1(T521C)、SLCO1B1(A388G)两个基因的多态性设
计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、SLCO1B1(T521C)测序引物、SLCO1B1(A388G)测序引物、阳性对照。
[0008]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0009][0010]优选的，所述SLCO1B1(T521C)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述SLCO1B1(A388G)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。
[0011]优选的，所述的SLCO1B1(T521C)测序引物、SLCO1B1(A388G)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
[0012]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
[0013]优选的，SLCO1B1(T521C)测序引物对应的测序区域为SLCO1B1(T521C)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；SLCO1B1(A388G)测序引物对应的测序区域为SLCO1B1(A388G)待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。
[0014]优选的，SLCO1B1(T521C)和SLCO1B1(A388G)共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:9所示。SEQ ID NO:9中“ddT”表示SLCO1B1(T521C)测序反应最后一个加入碱基ddTTP，该碱基的加入可终止该测序反应。SEQ ID NO:9中
“‑”
表示暂停试剂加入3min。该暂停期间会加入SLCO1B1(A388G)测序引物。
[0015]优选的，所述的试剂1包括：扩增缓冲液，18mM醋酸镁；
[0016]优选的，所述的试剂2包括：SLCO1B1(T521C)前引物(0.32uM)，SLCO1B1(T521C)后引物(0.32uM)，SLCO1B1(A388G)前引物(0.32uM)，SLCO1B1(A388G)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.25mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)；可在恒温条件下进行SLCO1B1(T521C)/SLCO1B1(A388G)同时扩增。
[0017]优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：40℃20min。
[0018]优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的SLCO1B1(T521C)、SLCO1B1(A388G)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0019]本专利技术还公开了一种采用上述试剂盒的汀类药物不良反应相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0020]a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用多重RPA扩增进行扩增；
[0021]b.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合。
[0022]c.变性液处理得到单链产物。
[0023]d.加入洗涤缓冲液漂洗。
[0024]e.向每个测序管中加入测序酶和测序底物。
[0025]f.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、SLCO1B1(T521C)测序引物、SLCO1B1(A388G)测序引物、ddATP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部。
[0026]g.焦磷酸测序：先加入SLCO1B1(T521C)测序引物，按照CAGCATA的顺序加入各种dNTP，加入ddTTP终止SLCO1B1(T521C)测序反应；再加入SLCO1B1(A388G)测序引物，按照GATCGATA的顺序加入各种dNT本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测他汀类药物代谢相关基因SLCO1B1 T521C和SLCO1B1 A388G两个基因的多态性，试剂盒包括如下组分：SLCO1B1 T521C扩增引物、SLCO1B1 T521C测序引物、SLCO1B1 A388G扩增引物、SLCO1B1 A388G测序引物和阳性对照。2.根据权利要求1所述的他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述SLCO1B1 T521C扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述所述SLCO1B1 A388G扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。4.根据权利要求1所述的他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述SLCO1B1 T521C测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，SLCO1B1 A388G测序引物如序列表SEQ ID NO:6所示。5.根据权利要求1所述的他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述所述测序引物为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物。6.根据权利要求1所述的他汀类药物代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、18mM醋酸镁、dNTPS、链置换DNA聚合酶、单链DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，李丽，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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