本发明专利技术公开了一种伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测伏立康唑代谢标志物CYP2C19 681G>A和CYP2C19 636G>A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP2C19 681G>A扩增引物、CYP2C19 681G>A测序引物、CYP2C19 636G>A扩增引物、CYP2C19 636G>A测序引物和阳性对照。本发明专利技术以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对伏立康唑药物疗效预测相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)基因多态性伏立康唑，为临床个性化用药给出基因角度的建议。为临床个性化用药给出基因角度的建议。为临床个性化用药给出基因角度的建议。
【技术实现步骤摘要】
一种伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
[0001]本专利技术涉及一种伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
技术介绍
[0002]伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药，它通过抑制真菌细胞色素P
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450有依赖性的羊毛固醇14α
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去甲基化酶，从而抑制羊毛固醇转化成麦角固醇。它被批准用于治疗侵袭性曲霉菌病，非嗜中性患者的念珠菌病，播散性念珠菌感染，食管念珠菌病以及由小孢子虫和镰刀菌引起的感染。美国传染病协会(IDSA)的指导方针建议将伏立康唑作为侵袭性曲霉菌的主要治疗方法，并作为一种念珠球菌病的替代疗法。伏立康唑主要经CYP2C19酶代谢，它表现出血药浓度的广泛差异，部分原因是编码CYP2C19酶的等位基因的突变。
[0003]CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C19快代谢者(extensive metabolizer，EM)与慢代谢者(poor metabolizer，PM)个体间伏立康唑的血液浓度存在显著差异，PM个体在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，建议减少用药剂量；EM和中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)个体可给予常规剂量。在常规剂量治疗时，若EM个体出现毒副反应或 PM疗效不佳，均应考虑更换药物。FDA批准的药物说明书中指出应用伏立康唑前需检测 CYP2C19基因型，以确保用药安全。
[0004]CYP2C19参与氯吡格雷、S
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美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediate metabolizer，IM)和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285， c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19 酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2导致剪接缺失，CYP2C19*3为终止密码子突变。EM 个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型； PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75～85％的PM由CYP2C19*2所致，约20～25％的PM由CYP2C19*3所致。CYP2C19酶存在基因多态性,能引起个体和种族间对伏立康唑表现出不同代谢能力,使血药浓度呈现显著个体差异。
[0005]目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。
技术实现思路
[0006]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以多重RPA扩增和焦磷酸测序技术为基础，获得一种伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
[0008]本专利技术的试剂盒针对CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括组分：试剂1～试剂5。
[0009]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0010][0011][0012]优选的，所述CYP2C19(681G>A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQID NO:2所示；所述CYP2C19(636G>A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQID NO:4所示。
[0013]优选的，所述的CYP2C19(681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
[0014]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键
骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
[0015]优选的，CYP2C19(681G>A)测序引物对应的测序区域为CYP2C19(681G>A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；CYP2C19(636G>A)测序引物对应的测序区域为 CYP2C19(636G>A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。
[0016]优选的，CYP2C19(681G>A)和CYP2C19(636G>A)共用一个分配指令如序列表SEQID NO:9所示。SEQ ID NO:9中“ddC”表示CYP2C19(681G>A)测序反应最后一个加入碱基ddCTP，该碱基的加入可终止该测序反应。SEQ ID NO:9中
“‑”
表示暂停试剂加入 3min。该暂停期间会加入CYP2C19(636G>A)测序引物。
[0017]优选的，所述的试剂1包括：扩增缓冲液，18mM醋酸镁；
[0018]优选的，所述的试剂2包括：CYP2C19(681G>A)后引物(0.32uM)，CYP2C19(681G>A) 后引物(0.32uM)，CYP2C19(636G>A)前引物(0.32uM)，CYP2C19(636G>A)后引物 (0.32uM)，dNTPS(3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/ μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)；可在恒温条件下进行CYP2C19 (681G>A)/CYP2C19(636G>A)同时扩增。
[0019]优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃25min。
[0020]优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的CYP2C19(681G>A)、CYP2C19 (636G>A)杂合型基因组DNA。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测伏立康唑代谢标志物CYP2C19 681G>A和CYP2C19 636G>A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP2C19 681G>A扩增引物、CYP2C19 681G>A测序引物、CYP2C19 636G>A扩增引物、CYP2C19 636G>A测序引物和阳性对照。2.根据权利要求1所述的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19 681G>A扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19 636G>A扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。4.根据权利要求1所述的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19 681G>A测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，CYP2C19 636G>A测序引物如序列表SEQ ID NO:6所示。5.根据权利要求1所述的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述测序引物为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物。6.根据权利要求1所述的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、18mM醋酸镁、dNTPS、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、结合单链核酸的重组酶和海藻糖。7.根据权利要求6所述的伏立康唑代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉，曾芳，周涛，龚卫静，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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