一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒用于检测待测样本中12个耐药菌菌种及耐药基因，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌、KPC基因、OXA

【技术实现步骤摘要】
一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

技术介绍

[0002]重症加强护理病房（Intensive Care Unit，ICU），又称加强监护病房综合治疗室，是为重症或昏迷患者提供隔离场所和设备，提供最佳护理、综合治疗、医养结合，术后早期康复、关节护理运动治疗等服务。ICU把危重病人集中起来，在人力、物力和技术上给予最佳保障，以期得到良好的救治效果。如果说医院是捍卫人们生命和健康的保障，那么ICU就是生命的最后一道防线。因此ICU内一旦发生了病原体感染，将造成严重的医疗事故。ICU内无菌环境是基础要求，也是最高标准，目前，革兰氏阴性菌是ICU内最常见的感染病原体，据有关文献统计，ICU内克雷伯氏菌检出率高达27%，大肠杆菌、铜绿假单胞菌检出率分别为25%、24%，其中更是可以检出致死率最高的耐药病原体如万古霉素耐药肠杆菌、产超广谱β内酰胺酶（ESBL）及耐碳青霉烯类的克雷伯菌属、碳青霉烯耐药不动杆菌属等。根据WHO新抗生素研究及开发优先解决的G
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菌名单，碳青霉烯耐药不动杆菌属的威胁级别为危急，猝死亡率在30~44%。
[0003]在我国，国内ICU中碳青霉烯耐药菌的检出率远高于其他科室，住院患者中历年革兰氏阴性菌的菌株数高达65.7~73%。而在临床分离菌统计中，呼吸道标本占38.7%，是所有标本类型中的排名最高的，呼吸道标本中排名前5位分离菌：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金葡菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。针对这种情况，目前ICU已采用了一定的检测方法定期检测相关耐药菌，检测方法包括平板培养法、基因测序法、芯片法、实时荧光PCR、原位杂交等。这些方法各有优缺点，平板培养是检测的金标准，但培养周期长，准确率低，操作复杂；芯片发通量高检测快，但对仪器有特殊要求，实时荧光PCR通量高操作简单，但探针成本较高，不利于长期使用；原位杂交法介入早，但检测成本高通量低，一般只适合于基因扩增和缺失异常的检测。
[0004]在测序法中，包括了一代二代三代测序方法，以及焦磷酸测序法，一代测序法测序时间长，检测成本高，而二代三代测序不仅成本高测序时间长，还需要专业的第三方公司分析结果，均不利于临床的长期使用。焦磷酸测序虽然需要单独配置焦磷酸测序仪，但介于一代和二代测序之间的焦磷酸测序法不仅检测成本低，也不需要依靠第三方机构，定制开发周期短，检测通量高灵敏度也高，是适于临床长期使用的耐药菌基因组检测的良好方法。因此，针对ICU等医疗重点区域，针对病原菌耐药基因组的检测，设计一款焦磷酸检测试剂盒是最经济有效的方式。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种常见病原菌及耐药基因
组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0006]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒的技术方案如下：本专利技术的试剂盒用于检测待测样本中12个耐药菌菌种及耐药基因，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌、KPC基因、OXA
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23基因、SHV基因和MecA基因的基因型，所述试剂盒包括扩增引物组、测序引物组、扩增液、扩增酶和测序底物。
如上表所示，所述扩增引物组包括：铜绿假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；鲍曼假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；金黄色葡萄球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；肺炎克雷伯氏菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；嗜麦芽窄食单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；大肠埃希氏菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23所示，粪肠球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示；屎肠球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31所示；KPC基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35所示；OXA
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23基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；SHV基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43所示；MecA基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47所示。
[0007]所述测序引物组包括：铜绿假单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.4所示；鲍曼假单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.8所示；金黄色葡萄球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.12所示；肺炎克雷伯氏菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.16所示；嗜麦芽窄食单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.20所示；大肠埃希氏菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.24所示，粪肠球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.28所示；屎肠球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.32所示；KPC基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.36所示；OXA
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23基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.40所示；SHV基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.44所示；MecA基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.48所示。
[0008]铜绿假单胞菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.1所示；鲍曼假单胞菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.5所示；金黄色葡萄球菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.9所示；肺炎克雷伯氏菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.13所示；嗜麦芽窄食单胞菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.17所示；大肠埃希氏菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.21所示，粪肠球菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.25所示；屎肠球菌的待测序列如序列表SEQ ID NO.29所示；KPC基因的待测序列如序列表SEQ ID NO.33所示；OXA
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23基因的待测序列如序列表SEQ ID NO.37所示；SHV基因的待测序列如序列表SEQ ID NO.41所示；MecA基因的待测序列如序列表SEQ ID NO.45所示。
[0009]所述的待测序列，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
[0010]优选的，待测样本来自于住院或门诊确诊或疑似下呼吸道感染患者痰液样本。
[0011]优选的，根据菌种的生存特性及与耐药基因的关系，部分联合检测组合包括但不限于：鲍曼不动杆菌、OXA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测待测样本中12个耐药菌菌种及耐药基因，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌、KPC基因、OXA
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23基因、SHV基因和MecA基因的基因型，所述试剂盒包括扩增引物组、测序引物组、扩增液、扩增酶和测序底物；所述所述扩增引物组包括：铜绿假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；鲍曼假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；金黄色葡萄球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；肺炎克雷伯氏菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；嗜麦芽窄食单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；大肠埃希氏菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23所示，粪肠球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示；屎肠球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31所示；KPC基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35所示；OXA
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23基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；SHV基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43所示；MecA基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47所示；所述测序引物组包括：铜绿假单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.4所示；鲍曼假单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.8所示；金黄色葡萄球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.12所示；肺炎克雷伯氏菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.16所示；嗜麦芽窄食单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.20所示；大肠埃希氏菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.24所示，粪肠球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.28所示；屎肠球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.32所示；KPC基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.36所示；OXA
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23基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.40所示；SHV基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.44所示；MecA基因的测序引物如序列表SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立波，孙悦，张元博，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：