一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测中华绒螯蟹螺原体探针法荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述检测中华绒螯蟹螺原体引物组包括一对特异性引物及对应的TaqMan探针，试剂盒还包括DNA聚合酶，UDG酶，2

【技术实现步骤摘要】
一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体地，涉及一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量 PCR检测试剂盒。

技术介绍

[0002]中华绒螯蟹螺原体作为一种新型致病菌，能引发中华绒螯蟹患“颤抖病”，还可感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)以及日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)等，基于已有研究的证实，螺原体不但能在宿主体内寄存，而且在自然条件下大多数还能诱发宿主产生严重的病症，常见的螺原体检测方法有分离培养、显微镜检查、血清学检测以及分子生物学检测方法。
[0003]目前螺原体分子生物学检测中应用较多的方法是聚合酶链式反应(PCR)，实时荧光定量PCR(Quantitative Real－time PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术最大的优势就是可以实现对PCR反应中的初始模板进行定量，克服了PCR的平台效应，使定量更灵敏、更精准、更特异(可进行单个核苷酸的区分)，普通PCR可对扩增反应的终点产物进行定性和半定量分析，而实时荧光定量PCR技术可以实现对起始模板准确定量，更灵敏。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一组检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR 引物。
[0005]本专利技术的另一个目的是提供一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒可直接从基质复杂(指检测中，背景基质对检测指标存在干扰，通常指宿主基因组核酸对检测靶标的干扰)的样品中检测中华绒螯蟹螺原体，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0007]一组检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR的引物，所述荧光定量PCR的引物，针对中华绒螯蟹螺原体基因设计的一对特异性引物和一个荧光探针，由正向引物F、反向引物 R、荧光探针Q组成，序列如下：
[0008]正向引物F：5
’
GCAATGCCGCGGTGAA 3
’
；
[0009]反向引物R：5
’
TGTGACGGGCGGTGTGT 3
’
；
[0010]荧光探针Q：5
’
CGTTCTCGGGTCTTG 3
’
；
[0011]一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒，包含如上所述的检测中华绒螯蟹螺原体的荧光定量PCR引物。
[0012]所述试剂盒还包括DNA聚合酶，UDG酶，2
×
反应缓冲液，密封液，标准阳性模板和阴
性对照。
[0013]优选地，所述试剂盒中引物组的正向引物F、反向引物R、荧光探针Q摩尔比为2：2： 1。
[0014]优选地，所述的2
×
反应缓冲液由buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，buffer缓冲液、甜菜碱与dNTPs的体积比为10：8：7。
[0015]优选地，所述DNA聚合酶为Taq酶，UDG酶为热敏型尿嘧啶
‑
DNA糖基化酶，密封液为矿物油。
[0016]优选地，所述标准阳性模板为含有中华绒螯蟹螺原体检测靶标基因的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。
[0017]更优选地，所述试剂盒的反应体系的成分组成为：正向引物F、反向引物R、荧光探针Q引物在反应体系中的终浓度分别为0.4μM、0.4μM、0.2μM，2
×
反应缓冲液12.5μL， DNA聚合酶2U，UDG酶0.5U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL；
[0018]反应体系的反应条件为37℃10min；95℃5min；95℃15s、60℃30s 45个循环。
[0019]本专利技术根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有中华绒螯蟹螺原体；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有中华绒螯蟹螺原体。
[0020]所述试剂盒在中华绒螯蟹螺原体检测中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022](1)特异性好：本专利技术用于引物设计的靶标基因是螺原体DNA中的一段特异性片段，针对该目的片段设计一对特异引物和一个荧光探针进行扩增，特异性强，
[0023](2)灵敏度高：对于含有中华绒螯蟹螺原体检测靶标基因的阳性质粒，最低检出限可达到101copies/μL；
[0024](3)实验重复性高：对阴性对照进行20次重复实验，引物没有扩增；对阳性对照质粒浓度进行20次重复实验，Ct值变异系数≤5％；对实际阳性样本进行12次重复实验，扩增曲线均呈典型“S”型曲线。
[0025](4)操作便捷：不需要使用昂贵、精密的设备，对仪器要求低，只需要一部实时荧光定量PCR仪就能反应和检测，条件比较简单。
[0026](5)鉴定简单：可直接从复杂样品中检测中华绒螯蟹螺原体，通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，适合现场快速、准确检测。
附图说明
[0027]图1为应用例1中荧光定量PCR法检测中华绒螯蟹螺原体的阴性对照重复性结果示意图。
[0028]图2为应用例2中荧光定量PCR法检测中华绒螯蟹螺原体的阳性对照灵敏度结果示意图。
[0029]图3为应用例3中荧光定量PCR法检测中华绒螯蟹螺原体的阳性对照稳定性结果示意图。
[0030]图4为应用例4中荧光定量PCR法检测中华绒螯蟹螺原体的实际样品结果示意图。
[0031]图5为应用例5中荧光定量PCR法检测中华绒螯蟹螺原体的实际样品特异性结果示
意图。
具体实施方式
[0032]下面结合说明书附图及具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0033]实施例1
[0034]一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒，组成成分为：一组检测中华绒螯蟹螺原体的荧光定量PCR引物组，DNA聚合酶，2
×
反应缓冲液，密封液，标准阳性模板和阴性对照。
[0035]所述检测中华绒螯蟹螺原体的荧光定量PCR引物组，由正向引物F、反向引物R、荧光探针Q组成，是以中华绒螯蟹螺原体特异靶标基因，采用引物设计软件 PrimerExpress3.0.1设计正向引物F、反向引物R、荧光探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中华绒螯蟹螺原体的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性鉴别中华绒螯蟹螺原体的引物和荧光探针，其序列如下：正向引物F：5
’
GCAATGCCGCGGTGAA 3
’
；反向引物R：5
’
TGTGACGGGCGGTGTGT 3
’
；荧光探针Q：5
’
CGTTCTCGGGTCTTG 3
’
；所述荧光探针Q的5
’
端标记6
‑
FAM荧光基团，3
’
端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团MGB。2.一种检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述中华绒螯蟹螺原体荧光定量PCR检测试剂盒中包括DNA聚合酶，2
×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈进会，郑玺，任向阳，付刚，陈珍容，张璜，高金艳，石磊，常彦磊，
申请(专利权)人：黄埔海关技术中心清远海关综合技术服务中心韶关海关综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：