一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，包括用于特异性扩增的3种血清型的禽致病性大肠杆菌基因序列的引物对组合，其中，所述的3种血清型的APEC菌株分别为EC164、EC165、EC168，所述用于特异性扩增O2型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O78型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O145型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。该禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法具有特异性好、快速简便、成本低廉的优势，可以快速检测优势流行血清型，掌握流行病学特征，为疾病防控提供依据。提供依据。提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法


[0001]本专利技术涉及兽医传染病检测
，具体为一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法。

技术介绍

[0002]禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）为革兰氏阴性菌，是肠外致病性大肠杆菌中的一种，在鸡和鸭、鹅等水禽中均有广泛的流行，感染后的病禽通常伴有全身性病变和特征性病变如心包炎、肝周炎、气囊炎等，甚至引起急性败血症而死亡。通常情况下幼禽对该病易感，多因急性败血症死亡，日龄较大的鸡具有一定的抵抗力，而成年产蛋鸡的大肠杆菌性败血性腹膜炎则可引起较高的的死亡率，且APEC还可以穿透蛋壳引起鸡胚感染，造成死胚、孵化率下降和弱雏率增加，给养禽业造成严重的经济损失。
[0003]禽致病性大肠杆菌血清型众多，同时，抗生素滥用乱用导致APEC耐药情况日趋严重，不易控制，而且由于防控过程中抗生素的大量使用导致禽产品存在药物残留，严重影响人体健康。
[0004]市场上一般通过对病原菌的检测来及时发现禽类的感染，目前对病原细菌的检测，主要依靠常规的细菌学培养方法，耗时长，操作繁琐，费时耗力，而PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，以解决上述
技术介绍
提出的目前市场上对于病原细菌检测中存在的耗时长、操作繁琐、费时耗力等难题。
[0006]为此，本专利技术提供如下技术方案：一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，包括用于特异性扩增的3种血清型的禽致病性大肠杆菌基因序列的引物对组合，其中，所述的3种血清型的APEC菌株分别为EC164、EC165、EC168。
[0007]进一步优化本技术方案，所述用于特异性扩增O2型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O78型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O145型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。
[0008]进一步优化本技术方案，所述PCR试剂盒包括2
×
RapidTaqMasterMix（withddH2O）。
[0009]进一步优化本技术方案，所述PCR试剂盒包括3种血清型的阳性对照样本。
[0010]进一步优化本技术方案，所述3种禽致病性大肠杆菌为EC164灭活菌液（O78阳性对
照）、EC165（O2阳性对照）、EC168（O145阳性对照）。
[0011]一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：S1：获取待检测菌株的纯培养物，得到菌液；S2：利用权力要求2、3中所述的PCR试剂盒，对步骤S1中的菌液纯培养物进行多重PCR；S3：对步骤S2的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小确定待检测APEC的血清型。
[0012]进一步优化本技术方案，所述步骤S2中PCR反应体系为：2μL核酸反应模板，12.5μL2
×
RapidTaqMasterMix，1μL上游引物，1μL下游引物，加入ddH2O补齐至25μL。
[0013]进一步优化本技术方案，所述步骤S2中PCR反应程序为：95℃5min；95℃15s、55℃15s、72℃30s，30个循环；72℃7min。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法根据我国流行的APEC
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O2、APEC
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O78、APEC
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O145等3种血清型菌株的O抗原序列的特异性，选择每种血清型O抗原特异性区域设计出3对血清型特异性PCR引物并制备试剂盒，该试剂盒克服了传统血清凝集试验耗时长、过程繁琐、实验成本高等不足，并且覆盖了基于流行病学调查的新发优势流行菌株，具有操作简便、花费时间少、成本低廉、检测结果准确等优势，在传统优势流行血清型基础上新增O145这一新发优势流行血清型，填补了国内尚无检测此种血清型的PCR检测试剂盒的空白；（1）特异性好、灵敏度高，本专利技术涉及的3种APEC血清型特异性引物仅能扩增对应血清型的APEC核酸模板，与其他血清型的APEC菌株核酸无交叉扩增现象；同时灵敏度试验结果显示本专利技术建立的3种APEC血清型特异性PCR检测方法的检测灵敏度在10
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21
至10
‑
22
拷贝之间，表明本专利技术建立的APEC血清型PCR检测方法具有非常好的特异性与灵敏度。
[0015]（2）实际应用效果十分明显，利用本专利技术试剂盒，专利技术人对分离自我国不同地区的共计201株APEC进行了血清型鉴定，检测结果与血清凝集试验完全一致，结果证实本专利技术建立的中国流行APEC血清型PCR检测方法准确、可靠，可有效用于中国不同时间与不同地域分离APEC菌株血清型的鉴定。
[0016]（3）与传统血清凝集试验比较具有显著的优势，本专利技术的方法具有简便、快捷、准确等优点，为开展我国APEC血清型的鉴定与分子流行病学调查研究提供了技术支持，本专利技术提供的APEC血清型PCR检测试剂盒与传统的血清凝集试验相比，具有快捷、准确、成本低廉等明显优势，可以快速检测优势流行血清型，掌握流行病学特征，为疾病防控提供依据。
[0017]（4）覆盖了基于流行病学调查的新发优势流行血清型O145，本专利技术检测的血清型包含传统认为的在中古流行的两种主要血清型（O2和O78），以及基于流行病学调查发现的新发优势流行血清型O145，能够快速筛查在中国优势流行的APEC菌株，快速了解病原流行情况，指导疾病防治。
附图说明
[0018]图1为三种APEC优势流行血清型代表菌株的PCR扩增结果；图2为三种APEC优势流行血清型代表菌株的三重PCR扩增结果；
其中，M：DNA分子标准量；泳道1至3分别代表O2、O78、O145菌株的PCR扩增结果；特亮条带以红色标示。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]实施例1本专利技术提供一种技术方案：一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，包括用于特异性扩增的3种血清型的禽致病性大肠杆菌基因序列的引物对组合，其中，所述的3种血清型的APEC菌株分别为EC164、EC165、EC168；用于特异性扩增O2型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O78型荚膜基因的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒，其特征在于：包括用于特异性扩增的3种血清型的禽致病性大肠杆菌基因序列的引物对组合，其中，所述的3种血清型的APEC菌株分别为EC164、EC165、EC168。2.根据权利要求1所述的一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒，其特征在于：所述用于特异性扩增O2型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O78型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；用于特异性扩增O145型荚膜基因的引物对分别具有SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂盒包括2
×
RapidTaqMasterMix（withddH2O）。4.根据权利要求3所述的一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂盒包括3种血清型的阳性对照样本。5.根据权利要求4所述的一种禽致病性大肠杆菌三重PCR鉴定试剂盒及鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：张炜，厉从志，王卓昊，郑祥宽，
申请(专利权)人：南京悦联生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：