一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的解聚酶Depo58及应用，该噬菌体解聚酶Depo58的制备包括如下步骤：S1.通过PCR及基因片段纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a

【技术实现步骤摘要】
一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种常见的人畜共患病原菌，近年来，多重耐药肺炎克雷伯菌已成为医源性感染的最主要病原体之一，该细菌不但对人类公共卫生事业造成了巨大威胁，而且在一定程度影响了动物养殖业的健康发展。
[0003]大多数肺炎克雷伯菌具有合成和分泌荚膜多糖的能力，荚膜多糖作为细菌的天然屏障可维持细菌毒力、粘附、阻断一些抗生素渗透，作为肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，荚膜多糖对公众健康构成巨大威胁，此外，一些肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植，因此，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验。
[0004]噬菌体解聚酶（depolymerase）通过降解细菌表面多糖，进而引导噬菌体吸附于宿主外膜蛋白。该酶通过随机攻击糖苷键以释放聚合物的重复单元，实现靶向降解荚膜多糖，诸多国内外研究表明，噬菌体解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共卫生领域具备一定的应用潜力。但是，不同来源、不同核酸序列以及不同蛋白结构的噬菌体解聚酶，对不同类型的荚膜多糖和生物被膜所表现的降解性能也是有非常大的差别。
[0005]例如，文献：“Biological properties and genomics analysis of vB_KpnS_GH
‑
K3, a Klebsiella phage with a putative depolymerase
‑
like protein，Virus Genes (2019) 55:696
–
706”公开了一种噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对K2型起作用，对KL2型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验，同时噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对KL2型起作用，对其他K型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用，该噬菌体解聚酶Depo58的制备与对肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解包括如下步骤：S1.通过PCR方法获得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a
‑
depo58质粒；S2.将pET28a
‑
depo58质粒转化到大肠杆菌BL21，筛选得到BL21
‑
depo58大肠杆菌，将该BL21
‑
depo58大肠杆菌在1L含有50
ꢀµ
g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期；S3.向上述LB液体培养基中加入异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷至终浓度为0.3 mM，并在16℃和180转/分振荡诱导表达16小时；S4.将诱导表达的BL21
‑
depo58菌液离心集菌离心后进行超声破碎，将上清液样品加入Ni
‑
NTA亲和层析柱，洗涤Ni柱以去除杂蛋白，最后收集洗脱液并经超滤得到纯化的噬菌体解聚酶Depo58；S5.将含有100μL对数期细菌的0.5%半固体LB培养基均匀平铺在固体LB培养基上，自然晾干后，取5
ꢀµ
L稀释浓度的Dpo58滴在双层平板上，缓冲液作为阴性对照，37℃培养箱中静置培养过夜，浓度为100
ꢀµ
g/mL~0.097
ꢀµ
g/mL的噬菌体解聚酶Depo58使平板上形成半透明的斑点；优选的：所述肺炎克雷伯菌噬菌株P719，名为Klebsiellaphage P719。
[0008]优选的：所述该噬菌体解聚酶Depo58为肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的原核表达和纯化产物。
[0009]优选的：所述该噬菌体解聚酶Depo58的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。
[0010]优选的：所述肺炎克雷伯菌包括KL2型肺炎克雷伯菌。
[0011]优选的：所述S1中肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因PCR产物经纯化后连接至pET28a质粒的酶切位点为NdeI和XhoI。
[0012]优选的：所述用于构建解聚酶表达载体的上游引物F（SEQIDNo:3）的DNA序列为：5
’‑
gtgccgcgcggcagccatATGGCACTATACAGACAAGGCAAA
‑3’
。
[0013]优选的：所述用于构建解聚酶表达载体下游引物R（SEQIDNo:4）的DNA序列为：5
’‑
gtggtggtggtggtgctcgagTTAGATAAAGTTTATTAGAACGCCATCG
‑3’
。
[0014]优选的：所述该解聚酶Depo58可对KL2型肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用；1、本专利技术公开了一种肺炎克雷伯菌噬菌株P719，通过对肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框（orf58），进行原核表达和纯化而获得了噬菌体解聚酶Depo58，该解聚酶能够清除KL2型肺炎克雷伯菌所形成的荚膜多糖；2、该噬菌体解聚酶Depo58可对细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构的形成具有高效的抑制作用，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。
附图说明
[0016]图1为本专利技术的噬菌体解聚酶Depo58的电泳图；图2为本专利技术噬菌体解聚酶Depo58的SDS
‑
PAGE电泳图；图3为不同浓度的解聚酶Depo58对KL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用，其特征在于：该噬菌体解聚酶Depo58的制备与对肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解包括如下步骤：S1.通过PCR及基因片段纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a
‑
depo58质粒；S2.将pET28a
‑
depo58质粒转化到大肠杆菌BL21，筛选得到BL21
‑
depo58大肠杆菌，将该BL21
‑
depo58大肠杆菌在1L含有50
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g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期；S3.向上述LB液体培养基中加入异丙基
‑
β
‑
D
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硫代半乳糖苷至终浓度为0.3 mM，并在16℃和180转/分振荡诱导表达16小时；S4.将诱导表达的BL21
‑
depo58菌液离心集菌离心后进行超声破碎，将上清液样品加入Ni
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NTA亲和层析柱，洗涤Ni柱以去除杂蛋白，最后收集洗脱液并经超滤得到纯化的噬菌体解聚酶Depo58；S5.随后将含有100
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L对数期细菌的0.5%半固体LB培养基均匀平铺在固体LB培养基上，自然晾干后，取5
ꢀµ
L稀释浓度的Dpo58滴在双层平板上，缓冲液作为阴性对照，37℃培养箱中静置培养过夜，浓度为100、25、6.256、1.56、0.39和0.097
ꢀµ
g/mL的噬菌体解聚酶Depo58使平板上形成半透明的斑点。2.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌噬菌株P719...

【专利技术属性】
技术研发人员：张炜，厉从志，李敏，李培，
申请(专利权)人：南京悦联生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：