碳水化合物结合模块变体制造技术

披露了碳水化合物结合模块变体，以及包含这些碳水化合物结合模块变体的糖苷水解酶变体。包含碳水化合物结合模块变体的具有糖苷水解酶活性的变体在蛋白酶的存在下具有改善的稳定性，并且可用于洗涤剂应用，例如衣物洗涤或餐具洗涤。或餐具洗涤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】碳水化合物结合模块变体
[0001]序列表的引用
[0002]本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。


[0003]本专利技术涉及碳水化合物结合模块变体，并且更优选地涉及家族1碳水化合物结合模块变体。

技术介绍

[0004]糖苷水解酶(例如纤维素酶)通常含有由接头区域连接的催化结构域和一个或多个碳水化合物结合模块(CBM)。
[0005]由于纤维素酶在洗衣过程中所观察到的益处，例如，颜色澄清、预防再沉积、抗起球/去除绒球和改善的白度，纤维素酶已在洗涤剂中使用多年，并且纤维素酶的特征在于能够将纤维素分子中的1,4
‑
β
‑
糖苷键切割成更小的分子。
[0006]在一些应用中，使用了复合纤维素酶组合物，其中该组合物包含多于一种纤维素降解酶(选自使用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β
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葡糖苷酶)，而其他应用使用主要包含一种或多种内切葡聚糖酶的酶组合物。
[0007]WO 1996/029397披露了用于洗涤剂用途的家族45内切葡聚糖酶。大多数商业洗涤剂组合物包含改善许多常见污渍的去除的蛋白酶。然而，蛋白酶也降解水性反应混合物中可获得的其他蛋白质，包括其他酶例如纤维素酶和其他的糖苷水解酶。因此，令人希望的是提供在蛋白酶存在下具有增加的稳定性的糖苷水解酶，例如纤维素酶及其变体。

技术实现思路

[0008]本专利技术涉及碳水化合物结合模块变体，并且更优选地涉及家族1碳水化合物结合模块变体。本专利技术还涉及包含碳水化合物结合模块变体的经修饰的糖苷水解酶。
[0009]本专利技术进一步涉及多核苷酸和包含该多核苷酸的表达构建体；包含这些多核苷酸或表达构建体的宿主细胞以及此类宿主细胞用于产生该碳水化合物结合模块变体以及包含本专利技术的碳水化合物结合模块变体的糖苷水解酶的用途。
[0010]还披露了包含该碳水化合物结合模块变体以及包含碳水化合物结合模块变体的糖苷水解酶的组合物、特别是洗涤剂组合物(例如液体洗涤剂组合物)，以及此类组合物用于洗涤纺织品的用途。
[0011]定义
[0012]除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本专利技术的上下文中使用的“一个/种(a/an)”和“该(the)”以及类似指称对象应解释为包括单数和复数二者。
[0013]等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序
列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0014]抗起球：术语“抗起球”表示从纺织品表面去除绒球和/或预防在纺织品表面上形成绒球。
[0015]碳水化合物结合模块：术语“碳水化合物结合模块”意指碳水化合物活性酶内的提供碳水化合物结合亲和力的区域(Boraston等人,2004,Biochem.J.[生物化学杂志]383:769
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781)。大多数已知的碳水化合物结合模块(CBM)是具有离散折叠的连续氨基酸序列。碳水化合物结合模块(CBM)典型地发现于酶的N
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末端处或C
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末端的端点处。已知一些CBM具有针对纤维素的特异性。
[0016]根据本专利技术有用的示例性CBM家族是CBM家族1、4、17、28、30、44、72和79的那些。再一次，参考cazy.org/Carbohydrate
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Binding
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Modules，CBM家族1包括几乎仅在真菌中发现的大约40个残基的模块。在许多情况下已经证明了纤维素结合功能，并且该纤维素结合功能似乎由间隔约10.4埃且形成扁平表面的三个芳香族残基介导。CBM家族4包括在细菌酶中发现的大约150个残基的模块。已经用木聚糖、β
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1,3
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葡聚糖、β
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1,3
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1,4
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葡聚糖、β
‑
1,6
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葡聚糖和无定形纤维素(但不用结晶纤维素)证明了这些模块的结合。CBM家族17包括大约200个残基的模块。已经证明了与无定形纤维素、纤维寡糖和衍生纤维素的结合。关于CBM家族28，来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)1139的内切
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1,4
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葡聚糖酶的模块与非结晶纤维素、纤维寡糖和β
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(1,3)(1,4)
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葡聚糖结合。对于CBM家族30，已经证明了产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)CelF的N
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末端模块与纤维素的结合。已经证明了热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)酶的C
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末端CBM44模块可同样好地结合纤维素和木葡聚糖。CBM家族72包括在来自多个家族的C
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末端糖苷水解酶中发现的130
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180个残基的模块，有时作为串联重复。发现CBM72(其发现于来自未培养微生物的内切葡聚糖酶上)与广谱的多糖结合，这些多糖包括可溶性和不溶性纤维素、β
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1,3/1,4
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混合连接的葡聚糖、木聚糖和β
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甘露聚糖。CBM家族79包括迄今为止仅在瘤胃球菌蛋白中发现的大约130个残基的模块。显示了黄色瘤胃球菌(R.flavefaciens)GH9酶与多种β
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葡聚糖的结合。
[0017]最优选的是CBM家族1(也称为“CBM1”)。
[0018]催化结构域：术语“催化结构域”意指含有该酶的催化机构的酶的区域。
[0019]cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
[0020]纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指水解纤维素材料的一种或多种(例如，几种)酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶(例如，EC 3.2.1.4)、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β
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葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β
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葡糖苷酶)，如在Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452
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481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种碳水化合物结合模块的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:173的多肽的位置34、37、14、18、21、22、25、27、28、29的一个或多个位置处包含取代，其中该变体与SEQ ID NO:SEQ ID NO:173的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性但小于100％序列同一性；并且其中该变体具有碳水化合物结合活性。2.如权利要求1所述的变体，该变体是碳水化合物结合模块家族1(CBM1)的变体。3.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包含至少一个选自由以下组成的组的取代：用H、Y、K、R，优选H、Y对位置34处的氨基酸残基进行的取代；用R对位置37处的氨基酸残基进行的取代；用W对位置14处的氨基酸残基进行的取代；用K、R对位置18处的氨基酸残基进行的取代；用E对位置21处的氨基酸残基进行的取代；用E、N、P对位置22处的氨基酸残基进行的取代；用E对位置25处的氨基酸残基进行的取代；用I对位置27处的氨基酸残基进行的取代；用P对位置28处的氨基酸残基进行的取代；以及用P对位置29处的氨基酸残基进行的取代。4.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包含至少一个选自由以下组成的组的取代：S34H；S34Y；S34K；S34R；L37R；Y14W；T18K；T18R；V21E；A22E；A22P；A22N；T25E；T27I；Q28P；以及L29P。5.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包含至少两个选自由以下组成的组的取代：用H、Y、K、R，优选H、Y对位置34处的氨基酸残基进行的取代；用R对位置37处的氨基酸残基进行的取代用W对位置14处的氨基酸残基进行的取代；用K、R对位置18处的氨基酸残基进行的取代；用E对位置21处的氨基酸残基进行的取代；用E、P对位置22处的氨基酸残基进行的取代；
用E对位置25处的氨基酸残基进行的取代；用I对位置27处的氨基酸残基进行的取代；用P对位置28处的氨基酸残基进行的取代；以及用P对位置29处的氨基酸残基进行的取代。6.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包含至少两个选自由以下组成的组的取代：S34H；S34Y；S34K；S34R；L37R；Y14W；T18K；T18R；V21E；A22E；A22N；A22P；T25E；T27I；Q28P；以及L29P。7.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包含选自由以下组成的组的取代：S34HS34YS34KS34RY14WT18KL37RS34Y,L37RT18K,S34HS34H,L37RT18K,S34Y,L37RT18RV21EA22EA22PA22NT25ET27IQ28PL29PS34H,L37R,Y14WS34H,L37R,T18K
S34H,L37R,Y14W,T18KS34H,L37R,T18RS34H,L37R,V21ES34H,L37R,A22ES34H,L37R,A22PS34H,L37R,A22NS34H,L37R,Q28PS34H,L37R,L29PS34H,L37R,T25ES34H,L37R,T27IS34H,L37R,V21E,A22ES34H,L37R,V21E,A22NY14W,T18R,S34H,L37RY14W,V21E,S34H,L37RY14W,A22E,S34H,L37RY14W,A22P,S34H,L37RY14W,A22N,S34H,L37RY14W,Q18P,S34H,L37RY14W,L29P,S34H,L37RY14W,T25E,S34H,L37RY14W,T27I,S34H,L37RY14W,V21E,A22E,S34H,L37RY14W,V21E,A22N,S34H,L37RT18K,V21E,S34H,L37RT18K,A22E,S34H,L37RT18K,A22P,S34H,L37RT18K,A22N,S34H,L37RT18K,Q28P,S34H,L37RT18K,L29P,S34H,L37RT18K,T25E,S34H,L37RT18K,T27I,S34H,L37RT18K,V21E,A22E,S34H,L37RT18K,V21E,A22N,S34H,L37RY14W,T18K,V21E,S34H,L37RY14W,T18K,A22E,S34H,L37RY14W,T18K,A22P,S34H,L37RY14W,T18K,A22N,S34H,L37RY14W,T18K,Q28P,S34H,L37RY14W,T18K,L29P,S34H,L37R
Y14W,T18K,T25E,S34H,L37RY14W,T18K,T27I,S34H,L37RY14W,T18K,V21E,A22E,S34H,L37RY14W,T18K,A21E,A22N,S34H,L37R。8.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体进一步包含来自具有糖苷水解酶活性的多肽的一个或多个催化结构域以及一个或多个接头。9.一种纤维素酶变体，该纤维素酶变体包含如权利要求1
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8中任一项所述的CBM变体。10.一种具有糖苷水解酶活性的变体，该变体包含(a)来自具有糖苷水解酶活性的多肽的一个或多个催化结构域；(b)一个或多个接头；以及(c)一个或多个如权利要求1
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8中任一项所述的碳水化合物结合模块变体。11.如权利要求10所述的糖苷水解酶变体，其中该接头是富含脯氨酸的接头。12.如权利要求11所述的糖苷水解酶变体，其中该富含脯氨酸的接头选自由以下组成的组：TTPPTPTPTPTPG(SEQ ID NO:12)TTPTPPTPTPTPTPG(SEQ ID NO:13)TTPTPTPPTPTPTPTPG(SEQ ID NO:14)TTPTPTPTPPTPTPTPTPG(SEQ ID NO:15)TPPTPPTPPTPPTPPTPPTPPTPPTPPTPPTPPG(SEQ ID NO:16)TPTTPTTPTTPTG(SEQ ID NO:17)TPTTPTTPTTPTTPTTPTG(SEQ ID NO:18)SPSSPSSPSSPSG(SEQ ID NO:19)SPSSPSSPSSPSSPSG(SEQ ID NO:20)SPPSPPSPPSPPSPPG(SEQ ID NO:21)SPPSPPSPPSPPSPPSPPSPPSPPSPPSPPG(SEQ ID NO:22)PPSSPSSPSSPSSPSSPSSPSG(SEQ ID NO:23)SPSPG(SEQ ID NO:24)SPSPSPSPSPG(SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：K詹森，L安德森，SG卡斯加德，JU范格尔，FW拉斯穆森，P田，CI约尔根森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：