极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种极端嗜热古菌Sulfolobus islandicus REY15A重组HhH

【技术实现步骤摘要】
极端嗜热古菌重组HhH
‑
GPD蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及极端嗜热古菌重组HhH
‑
GPD蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]据了解，碱基甲基化是造成DNA中碱基损伤的常见类型之一，细胞内源性和环境中存在的甲基化试剂会引起DNA中碱基的甲基化，目前主要碱基甲基化的种类包括，7
‑
甲基鸟嘌呤(N7
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methylguanine, 7
‑
meG)、3
‑
甲基腺嘌呤 (3
‑
methyladenine, 3
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meA)、6
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甲基鸟嘌呤 (O6
‑
methylguanine, O6
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meG)、1
‑
甲基腺嘌呤 (1
‑
methyladenine, 1
‑
meA)、3
‑
甲基鸟嘌呤 (3
‑
methylcytosine, 3
‑
meC)、4
‑
甲基胸腺嘧啶 (O4
‑
methylthymine, O4
‑
meT) 和methyl phosphotriesters (MPT)。研究发现，7
‑
meG、3
‑
meA和O6
‑
meG是DNA甲基化的主要形式，而 1
‑
meA、3
‑
meC、O4
‑
meT和MPT是DNA甲基化相对较少的形式。研究发现，O6
‑
meG和O4
‑
meT，具有高度的基因诱变性和基因毒理性，3
‑
meA、1
‑
meA、3
‑
meC和3
‑
meG能够阻止DNA复制和转录，具有细胞毒理性和相对较低的基因诱变性。因此，不同类型的碱基甲基化会导致基因突变和干扰细胞的DNA复制和修复过程，很有必要检测DNA中的甲基化碱基。现有的检测DNA甲基化方法主要包括超高效液相色谱
‑
串联质谱法、光交联测序、单细胞实时测序等。尽管这些方法能够达到检测DNA甲基化的目的，但是它们仍存在一些局限性，比如步骤繁琐或者设备昂贵。
[0003]DNA糖苷酶是一类水解DNA中N
‑
C糖苷键的酶，进而切除DNA中的损伤碱基，因此在DNA损伤碱基修复、避免细胞突变、检测DNA突变方面具有重要的作用。目前，DNA糖苷酶可分为单功能DNA糖苷酶和双功能DNA糖苷酶。单功能DNA糖苷酶仅切除DNA中的损伤碱基，从而形成无碱基位点。而双功能DNA糖苷酶不仅能够切除DNA中特定的碱基，而且还能够进一步在所产生的无碱基位点处切开磷酸二酯键。
[0004]HhH (Helix
‑
hairpin
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Helix) DNA 糖苷酶超家族目前包括六个家族的成员：Nth、OggI、MutY/Mig、AlkA、MpgII和OggII。HhH DNA 糖苷酶能够切除DNA中脱氨基化碱基、氧化碱基和烷基化碱基等。HhH DNA糖苷酶广泛地分布在细菌、真核生物和古菌中，细菌和真核生物来源的HhH DNA糖苷酶已有较多的研究，而古菌HhH DNA糖苷酶的研究相对较少。冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus REY15A是研究古菌DNA复制和修复的重要模式生物，其基因组编码一种HhH
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GPD (Sis
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HhH
‑
GPD)蛋白，属于HhH DNA糖苷酶超家族。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种极端嗜热古菌重组HhH
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GPD蛋白及其制备方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种无需使用昂贵仪器、无繁琐步骤、实用性强且能高效、特异并灵敏地识别检测DNA甲基化的方法。
[0007]本专利技术提供了一种极端嗜热古菌重组HhH
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GPD蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2
所示。
[0008]编码上述蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供了上述蛋白的制备方法，该蛋白由能够表达Sis
‑
HhH
‑
GPD (NCBI: ADX84373) 的基因工程菌产生，所用的菌株为E. coli BL21 (DE3) pLysS细胞，能够在短时间内大量表达目的蛋白。
[0010]本专利技术利用基因工程技术构建了一株能够过量表达耐热HhH
‑
GPD蛋白的基因工程菌，通过诱导、表达和镍离子亲和纯化等步骤，得到电泳级的重组酶蛋白。该蛋白在高温条件下能够专一性地切除DNA中的1
‑
meA，并对含有1
‑
meA的DNA具有较高的亲和力显著地高于结合正常的DNA，从而为检测甲基化的DNA提供简便的方法。因此，该蛋白在涉及到DNA中甲基化碱基的检测及其修复相关的分子生物学领域具有应用的潜力。
[0011]本专利技术能够表达Sis
‑
HhH
‑
GPD的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：步骤1、利用引物，以S. islandicus REY15A基因组为模板进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果；所用的正向引物序列为：5'
‑ꢀ
CGCGGATCCATGGTTCGTAAAATACTTGAC
ꢀ‑
3'，反向引物序列为：5'
‑ꢀ
CCGCTCGAGTCACGAGGAATTTTCTCTATA
ꢀ‑
3'；步骤2、对步骤1得到的PCR扩增产物和pET
‑
28a Plus载体进行双酶切 (BamHI/XhoI) 反应；步骤3、通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物和pET
‑
28a Plus载体片段，进行连接反应；步骤4、将步骤3得到的连接产物转化到感受态细胞E. coli DH5α中，过夜培养（即涂布于含有卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜），挑取克隆，并提取质粒进行测序验证，得到基因序列正确的克隆质粒；步骤5、将基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞E. coli BL21(DE3) plysS细胞中，得到能够表达Sis
‑
HhH
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GPD的基因工程菌，进行诱导表达；步骤6、通过超声波破碎和镍离子亲和纯化的步骤，对该酶进行纯化，得到电泳级纯蛋白样品Sis
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HhH
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GPD。
[0012]本专利技术进一步地提供了上述蛋白在检测DNA甲基化中的应用。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.极端嗜热古菌重组HhH
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GPD蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.编码如权利要求1所述的蛋白的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1或2所述的蛋白的制备方法，其特征在于：所述蛋白由能够表达Sis
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HhH
‑
GPD的基因工程菌产生，所用的菌株为E. coli BL21 (DE3) pLysS细胞。4.如权利要求3所述的能够表达Sis
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HhH
‑
GPD的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、利用引物，以S. islandicus REY15A基因组为模板进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果；所用的正向引物序列为：5'
‑ꢀ
CGCGGATCCATGGTTCGTAAAATACTTGAC
ꢀ‑
3'，反向引物序列为：5'
‑ꢀ
CCGCTCGAGTCACGAGGAATTTTCTCTATA
ꢀ‑
3'；步骤2、对步骤1得到的PCR扩增产物和pET
‑
28a Plus载体进行双酶切 (Bam...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立奎，殷有成，李铮，姜董豪，
申请(专利权)人：扬州大学广陵学院，
类型：发明
国别省市：