厚壁菌门与拟杆菌门的核酸检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种厚壁菌门与拟杆菌门的核酸检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术以厚壁菌门与拟杆菌门的高度保守区为靶区域，通过设计优化特异性引物和探针，建立了可同时检测厚壁菌门与拟杆菌门的检测方法。与传统的细菌鉴定方法相比，本发明专利技术具有特异性强、灵敏度高、操作便捷、检测快速、准确等优势，可用于实际样本肠道菌群的厚壁菌门与拟杆菌门的相对定量检测，也可用于定量检测厚壁菌门与拟杆菌门的比值，有助于肥胖炎症与2型糖尿病的研究，对于通过对肠道菌群的研究来调节肠道菌群促进肠道健康具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
厚壁菌门与拟杆菌门的核酸检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于微生物学检测领域
更具体地，涉及厚壁菌门与拟杆菌门的核酸检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]肥胖和糖尿病的发病率呈逐年增高趋势，但其发病机制尚未阐明。饮食作为重要的环境因素，其代谢与肠道微生物密切相关。越来越多研究表明肠道菌群失调(宿主和肠道微生物群之间的共生关系发生改变)与各种疾病有关，包括炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征、肥胖、过敏、自身免疫性疾病和脑疾病。因此，许多研究者认为可以通过调节肠道菌群来促进肠道健康。
[0003]人体肠道菌群主要有厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)组成，其余多为放线菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。其中，厚壁菌门和拟杆菌门约占人体肠道菌群的90％以上。在正常生理情况下，肠道菌群对机体的代谢及肠道局部微环境起着极其重要的作用。厚壁菌门与拟杆菌门的比值不仅会影响机体的碳水化合物代谢，被认为是与肥胖炎症过程相关的一个重要因素；而且改变了短链脂肪酸的产生，诱发胰岛素抵抗，从而影响2型糖尿病(T2DM)。为了更好地研究厚壁菌门与拟杆菌门的比值与肥胖炎症和T2DM的关联性，需要更精确地筛选出肥胖易感性的生物标志物、T2DM的菌群标志物，建立一种灵敏、精确、快速的方法用于定量检测厚壁菌门与拟杆菌门的比值，有助于肥胖炎症与2型糖尿病的研究。
[0004]目前，肠道菌群的检测方法主要包括传统培养法和分子生物学法两大类。传统培养法是微生物鉴定的基本方法，但其存在耗时长、培养要求高、影响因素多等问题。分子生物学方法为肠道细菌的检测提供了更多可能，它具有检测时间短、灵敏度高、结果准确等优势，弥补了传统培养法的诸多不足，被广泛地应用于肠道微生态生物研究。专利CN 108486228 A公开了一种预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，提供了四组分别检测拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的引物组，分别采用荧光定量染料法进行检测，实现了通过检测人体肠道菌群门分类水平结构，为脓毒症的诊断提供可靠的感染证据以及感染的病原学类型。但由于分别检测四种菌，并不能实现同时检测。
[0005]目前没有针对厚壁菌门与拟杆菌门同时检测的方法和相关试剂的有关报道，为了更好地研究厚壁菌门与拟杆菌门的比值与肥胖炎症和糖尿病的关联性，需要建立一种灵敏、精确、快速的方法用于同时定量检测厚壁菌门与拟杆菌门的方法，有助于肥胖炎症与糖尿病的研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是建立一种同时检测厚壁菌门与拟杆菌门的试剂盒及检测方法，为在肠道菌群上的研究对肥胖炎症与糖尿病提供技术支持。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供厚壁菌门与拟杆菌门的检测引物组。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供厚壁菌门与拟杆菌门的检测引物组的应用。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供厚壁菌门与拟杆菌门核酸检测试剂盒。
[0010]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0011]本专利技术分析了厚壁菌门与拟杆菌门的基因组信息与特性，最终选择了合适的保守区域，并在这些保守区域中设计出一系列针对检测厚壁菌门与拟杆菌门的特异性引物。通过大量筛选和优化，最终确定了一组灵敏度和特异性最优的引物和探针组合序列。
[0012]本专利技术提供的厚壁菌门与拟杆菌门的检测引物组，其中，检测厚壁菌门的上游引物、下游引物和探针分别为Fir
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F1、Fir
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R1和Fir
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P1，其序列如SEQ ID NO.1～3所示；检测拟杆菌门的上游引物、下游引物和探针分别为Bac
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F1、Bac
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R1和Bac
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P1，其序列如SEQ ID NO.16～18所示。
[0013]本专利技术还提供了所述检测引物组在制备同时检测肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的试剂中的应用。
[0014]本专利技术提供了一种厚壁菌门和拟杆菌门的核酸检测试剂盒，所述试剂盒含有厚壁菌门与拟杆菌门的检测引物组。
[0015]进一步地，所述试剂盒还含有荧光PCR反应所需试剂：5
×
DNA PCR Buffer，酶系，ddH2O。
[0016]本专利技术提供了一种厚壁菌门和拟杆菌门的核酸检测试剂盒在检测肠道菌群厚壁菌门与拟杆菌门中的应用。
[0017]所述试剂盒的使用方法包含以下步骤：
[0018]S1.提取待测粪便样本中的核酸作为模板；
[0019]S2.取S1步骤中的模板，利用厚壁菌门与拟杆菌门检测引物组进行荧光定量PCR反应；
[0020]S3.分析S2步骤的反应结果。
[0021]所述步骤S3的结果判断方法如下：
[0022]阳性检测结果的判断依据为：对应荧光通道内出现扩增曲线且Ct值≤38；
[0023]通过分别读取厚壁菌门Fir和拟杆菌门Bac的Ct值，计算所测样本中厚壁菌门与拟杆菌门的菌群比值，Fir/Bac菌群比值越大代表肥胖程度越高，Fir/Bac菌群比值越小代表存在2型糖尿病风险越高。
[0024]优选地，所述方法步骤S2中的荧光定量PCR反应体系为：待检测核酸样本5μL，5
×
DNA PCR Buffer 5μL，上游引物0.1μL，下游引物0.1μL，探针0.1μL，酶系3μL，ddH2O 6.4μL。
[0025]优选地，所述方法步骤S2中的荧光定量PCR反应条件为：50℃，2min，1个循环；95℃，5min，1个循环；95℃，5sec，60℃，20sec，45个循环。
[0026]优选地，所述方法步骤S2中的荧光定量PCR反应体系中引物和探针的终浓度为10pmol。
[0027]另外，上述荧光定量PCR反应体系中，所述酶系可为本领域荧光定量PCR反应的常用酶系或市购可得到的能够满足荧光定量PCR反应酶要求的酶系。
[0028]本专利技术具有以下有益效果：
[0029]本专利技术基于荧光定量PCR
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染料法，以厚壁菌门与拟杆菌门的高度保守区为靶区域，通过设计筛选特异性引物和探针，建立了可同时检测厚壁菌门与拟杆菌门的检测方法。
本专利技术所述厚壁菌门与拟杆菌门的检测方法与传统的细菌鉴定方法相比，具有特异性强、灵敏度高、操作简洁、检测快速、准确等优势，为2型糖尿病肠道保护菌的研究提供快速、特异、可重复的检测手段，可用于实际样本中厚壁菌门与拟杆菌门的相对定量检测，用于肠道保护菌的研究。
附图说明
[0030]图1为厚壁菌门引物组合A1筛选结果。
[0031]图2为厚壁菌门引物组合A2筛选结果。
[0032]图3为厚壁菌门引物组合A3筛选结果。
[0033]图4为厚壁菌门引物组合A4筛选结果。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种厚壁菌门与拟杆菌门的检测引物组，其特征在于，包含检测厚壁菌门与拟杆菌门的多重qPCR引物和探针，检测厚壁菌门的上游引物、下游引物和探针分别为Fir
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F1、Fir
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R1和Fir
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P1，其序列依次如SEQ ID NO.1～3所示；检测拟杆菌门的上游引物、下游引物和探针分别为Bac
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F1、Bac
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R1和Bac
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P1，其序列依次如SEQ ID NO.16～18所示。2.根据权利要求1所述检测引物组，其特征在于，所述厚壁菌门探针的5
’
端荧光发射基团为FAM，3
’
端淬灭基团为BHQ1；拟杆菌门探针的5
’
端荧光发射基团为TEXAS RED，3
’
端淬灭基团为BHQ2。3.权利要求1或2所述检测引物组在制备同时检测肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门试剂中的应用。4.一种同时检测厚壁菌门和拟杆菌门的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述检测引物组。5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还含有荧光PCR反应所需试剂：5
×
DNA PCR Buffer，酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：方鹏宇，郭红辉，
申请(专利权)人：广东君道营养科技有限公司，
类型：发明
国别省市：