四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒，四种肠道保护菌即假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌。本发明专利技术以上述四种肠道保护菌的16S rRNA的高度保守区为靶区域，通过设计筛选特异性引物及探针，建立了可同时检测上述四种肠道保护菌的检测方法和检测试剂盒。所述肠道保护菌的检测方法与传统的细菌鉴定方法相比，具有特异性强，灵敏度高，操作便捷，检测快速、准确等优势，可用于实际样本中肠道保护菌的定性检测。用于实际样本中肠道保护菌的定性检测。用于实际样本中肠道保护菌的定性检测。

【技术实现步骤摘要】
四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒


[0001]本专利技术属于肠道微生物检测
更具体地，涉及四种肠道保护菌的检测组合物、检测方法及核酸检测试剂盒(PCR
‑
荧光探针法)。

技术介绍

[0002]肠道微生物对生物体的物质代谢、能量流动以及信号传导等有重要的调控作用，并且对动物的饮食、营养、免疫、神经调节以及慢性疾病的产生有重要的影响。对肠道微生物进行深入细致的研究是理解各种慢性疾病及免疫与病原微生物疾病发生机理的重要的方式方法。
[0003]2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是临床常见的一种代谢性疾病，机体多发生糖脂代谢紊乱，导致患者血糖长时间处于较高水平，对其身体健康造成严重影响。2型糖尿病的发生原因不仅限于饮食结构和运动量的变化，还和肠道菌群有着密不可分的关系，目前对肠道菌群的研究已成为防治2型糖尿病世界研究热点。研究发现，糖尿病与肠道菌群的数量发展有着一定的相关性，当血糖值偏高时，肠道内的假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)和艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)等肠道保护菌的数量会相应减少，它们作为益生菌可以减少2型糖尿病及并发症的发生，而建立一种灵敏、精确、快速的用于定性检测肠道保护菌的方法，有助于肠道保护菌与2型糖尿病的研究。
[0004]荧光定量PCR是一种新型的定量检测技术，现已被广泛应用于mRNA表达的研究、单核苷酸多态性(SNPs)的测定以及病原体的测定等多个方面。荧光定量PCR虽具有价格便宜，适用性广等优点，但其特异性差，不能区分扩增产物与非特异性扩增，也不能对不同目标产物进行分别定量。而探针法荧光定量PCR则弥补了这些不足，多重荧光定量PCR则实现了同时对多个目标产物进行定量。如中国专利CN110904250A公开了一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法。但由于多重扩增具有偏好性，且各产物间相互干扰性较强，使其引物和探针的设计，以及方法的建立难度增大，并且检测方案设计与检测对象基因信息特点有直接的关系。目前还未有针对假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的肠道保护菌同时进行检测的试剂和方法报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种能够同时检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测组合物、检测方法及检测试剂盒。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测组合物。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测方法。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的核酸检测试剂盒。
[0009]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0010]本专利技术分析了假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种保护菌的基因组信息与特性，最终选择了16S rRNA保守区域，并在这些保守区域中设计出针对检测4种保护菌的特异性引物和探针序列。通过大量的筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合序列。
[0011]本专利技术首先提供了四种肠道保护菌的检测组合物，其包含检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的多重qPCR引物和探针；其中，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的上游引物分别为Bi.p
‑
F、Clo.b
‑
F和AK.m
‑
F，其序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的下游引物为Bi.p
‑
R，其序列如SEQ ID NO.4所示；检测干酪乳酸杆菌的上下游引物Lac.c
‑
F/R序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；检测小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌和干酪乳酸杆菌的探针分别为Bi.p
‑
P、Clo.b
‑
P、AK.m
‑
P和Lac.c
‑
P，其序列依次如SEQ ID NO.7～10所示；上述探针的5
’
端标记有不同的荧光发射基团，3
’
端标记有淬灭基团。
[0012]优选地，探针Bi.p
‑
P的5
’
端荧光发射基团为FAM，3
’
淬灭基团为BHQ1；探针Clo.b
‑
P的5
’
端荧光发射基团为VIC，3
’
淬灭基团为BHQ1；探针Lac.c
‑
P的5
’
端荧光发射基团为TEXAS RED，3
’
淬灭基团为BHQ2；探针AK.m
‑
P的5
’
端荧光发射基团为CY5，3
’
淬灭基团为BHQ2，见实施例1。
[0013]本专利技术还提供了假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测方法，首先提取待测样本中的核酸作为模板，加入含有SEQ ID NO.1～10所示检测组合物的反应体系中进行多重荧光PCR反应，通过不同荧光通道的多重qPCR反应结果判断所测样本中是否含有假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和/或艾克曼菌，阳性检测结果的判断依据为对应荧光通道内出现扩增曲线且Ct值≤38。
[0014]其中，所述样本可为粪便。
[0015]优选地，多重荧光PCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5
×
DNA PCR Buffer 5μL，Bi.p
‑
F 0.25μL，Clo.b
‑
F 0.25μL，AK.m
‑
F 0.15μL，Lac.c
‑
F 0.25μL，Lac.c
‑
R 0.25μL，Bi.p
‑
R 0.25μL，Bi.p
‑
P 0.4μL，Clo.b
‑
P 0.25μL，AK.m
‑
P 0.25μL，Lac.c
‑
P 0.15μL，酶系3μL，dNTPs 1μL，H2O 8.55μL，见实施例2。
[0016]其中，所述dNTPs中含有2'
‑
脱氧尿苷
‑
5'
‑
三磷酸盐(dUTP)；所述酶系中包含0.5μL的热启动Taq酶和0.5μL的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，其余为酶稀释液。
[0017]UDG酶的作用为防止扩增产物的污染，其作用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.四种肠道保护菌的检测组合物，其特征在于，包含检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的多重qPCR引物和探针；其中，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的上游引物分别为Bi.p
‑
F、Clo.b
‑
F和AK.m
‑
F，其序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的下游引物为Bi.p
‑
R，其序列如SEQ ID NO.4所示；检测干酪乳酸杆菌的上下游引物Lac.c
‑
F/R序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；检测小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌和干酪乳酸杆菌的探针分别为Bi.p
‑
P、Clo.b
‑
P、AK.m
‑
P和Lac.c
‑
P，其序列依次如SEQ ID NO.7～10所示；上述探针的5
’
端标记有不同的荧光发射基团，3
’
端标记有淬灭基团。2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，Bi.p
‑
P的5
’
端荧光发射基团为FAM，3
’
淬灭基团为BHQ1；Clo.b
‑
P的5
’
端荧光发射基团为VIC，3
’
淬灭基团为BHQ1；Lac.c
‑
P的5
’
端荧光发射基团为TEXAS RED，3
’
淬灭基团为BHQ2；AK.m
‑
P的5
’
端荧光发射基团为CY5，3
’
淬灭基团为BHQ2。3.假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测方法，其特征在于，提取待测样本中的核酸作为模板，加入含有权利要求1所述检测组合物的反应体系中进行多重荧光PCR反应，通过不同荧光通道的多重qPCR反应结果判断所测样本中是否含有假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和/或艾克曼菌，阳性检测结果的判断依据为对应荧光通道内出现扩增曲线且Ct值≤38。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，多重荧光PCR反应的反应体系为：待检...

【专利技术属性】
技术研发人员：方鹏宇，郭红辉，
申请(专利权)人：广东君道营养科技有限公司，
类型：发明
国别省市：