一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒。本发明专利技术利用多重荧光PCR技术，通过对引物、探针的设计筛选及反应体系的优化，建立了2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的检测方法，实现了四种菌的一管多重检测，具有检测特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，且操作简单方便、快速、节约耗材、成本低廉，可作为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的定性检测试剂，为2型糖尿病的研究提供快速、特异、可重复的检测手段。复的检测手段。复的检测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于微生物检测
更具体地，涉及一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针、检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]随着我国经济、环境、生活水平的改变，糖尿病患病率逐年上升，其中2型糖尿病(T2DM)的患病比例更高。2型糖尿病被认为是由一系列危险因素引起的，如遗传、年龄、肥胖和不健康的生活方式等，越来越多的证据表明，2型糖尿病与肠道菌群的数量发展有着一定的相关性，通过检测肠道菌群，可以为2型糖尿病的诊断提供辅助证据。例如，中国专利CN 109797190A公开了一种用于评估II型糖尿病风险的微生物标志物及其应用，其微生物标志物包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普雷沃菌属(Prevotella)、梭菌属(Clostridium)、罗氏菌属(Roseburia)、肠球菌属(Enterococcus)或韦荣球菌属(Veillonella)中任意两种以上的组合。另有研究表明，多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、柔嫩梭菌(Clostridium Leptum)、球形梭菌(Clostridium Coccoides)以及毛螺菌(Lachnospiraceae Bacterium)是2型糖尿病患者的易感肠道菌，糖尿病患者进食后，血糖值升高时，其丰度也会相应升高，可作为2型糖尿病风险的微生物标志物。
[0003]目前，肠道菌群的检测方法主要包括传统培养法和分子生物学法两大类。传统培养法是微生物鉴定的基本方法，但其存在耗时长、培养要求高、影响因素多等问题。分子生物学方法的出现则为肠道细菌的检测提供了更多可能，它具有检测时间短、灵敏度高、结果准确等优势，弥补了传统培养法的诸多不足，被广泛地应用于肠道微生态生物研究。其中，由于多重qPCR方法可同时检测多种肠道菌，具有检测速度快，成本低等优势，在肠道菌的检测方面应用广泛，但多重qPCR方法的建立难度比普通qPCR高很多，多重qPCR对引物和探针的特异性要求很高，否则会因同属内菌的DNA序列同源性较高，出现非特异性扩增，造成假阳性；引物和探针之间也不能相互干扰，否则将导致检测结果不准确；引物的扩增效率也会影响结果的准确性，如果引物的扩增效率相差较多，当在同一反应体系中同时进行扩增时，会因各引物间扩增效率的不同，导致样本初始DNA扩增的不均衡，一些含量低的菌或者引物扩增效率低的菌无法同含量高或者扩增效率高的引物竞争，导致此类菌的扩增产物较少，荧光信号较弱，造成假阴性结果。
[0004]虽国内外已有不少关于肠道菌的实时荧光PCR检测方法与应用的报道，例如中国专利CN 110904250A公开了用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，其可同时检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌。但目前还未有同时检测2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌这四种2型糖尿病易感肠道菌的多重荧光PCR方法，因此，提供一种检测上述四种菌的多重qPCR方法对2型糖尿病的研究具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服尚未有同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌这四种2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物、探针方法及试剂盒的缺陷和不足，提供2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒。
[0006]本专利技术的目的是提供一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针。
[0007]本专利技术的另一目的是提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法。
[0008]本专利技术的再一目的是提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒。
[0009]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0010]本专利技术利用多重荧光PCR技术，以2型糖尿病的易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的16S rRNA的高度保守区为靶区域，设计特异性引物和荧光探针，从中筛选出了可用于同时检测上述四种肠道菌的qPCR引物和探针。本专利技术还利用基因重组技术，构建了含有多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的目的基因的重组质粒，作为qPCR检测的阳性对照。在所述qPCR引物和探针以及重组质粒的基础上，建立了相应的检测方法，并提供了检测多种肠道菌的多重qPCR试剂盒。
[0011]本专利技术首先提供了一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针，包括用于检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的一对引物和四条探针；其中，用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的引物T2DM
‑
F1/R1的序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，用于检测多形拟杆菌的探针BT
‑
P1的序列如SEQ ID NO.3所示，用于检测柔嫩梭菌的探针CL
‑
P2的序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测球形梭菌的探针CC
‑
P1的序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测毛螺菌的探针LB
‑
P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述四条探针的5
’
端标记有不同的荧光发射基团，3
’
端标记有淬灭基团。
[0012]优选地，SEQ ID NO.3所示探针的5
’
端荧光发射基团为FAM，SEQ ID NO.4所示探针的5
’
端荧光发射基团为VIC，SEQ ID NO.5所示探针的5
’
端荧光发射基团为Cy5，SEQ ID NO.6所示探针的5
’
端荧光发射基团为TEXAS RED，3
’
端淬灭基团均为BHQ1，见实施例1。
[0013]本专利技术还提供了一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法，包含以下步骤：
[0014]S1.提取待测样本中的核酸；
[0015]S2.以步骤S1所得核酸为模板，用SEQ ID NO.1～2所示引物和SEQ ID NO.3～6所示探针进行qPCR反应；
[0016]S3.反应结束后，通过探针序列上所携带的不同荧光通道曲线及Ct值判断结果，若出现扩增曲线且Ct值≤38，则代表对应菌的检测结果为阳性。
[0017]其中，所述待测样本可为粪便。
[0018]优选地，步骤S2所述qPCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5
×
DNA PCR Buffer 5μL，40pmol/μL的T2DM
‑
F1 0.25μL，40pmol/μL的T2DM
‑
R1 0.25μL，20pmol/μL的BT
‑
P1 0.15μL，20pmol/μL的CC
‑
P1 0.5μL，20pmol/μL的CL
‑
P20.5μL，20pmol/μL的LB
‑
P2 0.25μL，酶系3μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针，其特征在于，包括用于检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的一对引物和四条探针；其中，用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的引物T2DM
‑
F1/R1的序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，用于检测多形拟杆菌的探针BT
‑
P1的序列如SEQ ID NO.3所示，用于检测柔嫩梭菌的探针CL
‑
P2的序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测球形梭菌的探针CC
‑
P1的序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测毛螺菌的探针LB
‑
P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述四条探针的5
’
端标记有不同的荧光发射基团，3
’
端标记有淬灭基团。2.根据权利要求1所述引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO.3所示探针的5
’
端荧光发射基团为FAM，SEQ ID NO.4所示探针的5
’
端荧光发射基团为VIC，SEQ ID NO.5所示探针的5
’
端荧光发射基团为Cy5，SEQ ID NO.6所示探针的5
’
端荧光发射基团为TEXAS RED，3
’
端淬灭基团均为BHQ1。3.一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：S1.提取待测样本中的核酸；S2.以步骤S1所得核酸为模板，用权利要求1所述引物和探针进行qPCR反应；S3.反应结束后，通过探针序列上所携带的不同荧光通道曲线及Ct值判断结果，若出现扩增曲线且Ct值≤38，则代表对应菌的检测结果为阳性。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：方鹏宇，郭红辉，
申请(专利权)人：广东君道营养科技有限公司，
类型：发明
国别省市：