口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法，引物体系包括沙门氏菌23S rRNA引物组、沙门氏菌sseL引物组、金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组和金黄色葡萄球菌Coa引物组4组引物组，每组引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP；引物体系包括SEQ IDNo.1～SEQ ID No.16的引物。本发明专利技术实现利用LAMP法对口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，检测过程对硬件环境要求不高，检测流程简单，且检测时间快；具有简便高效、结果准确、成本低的优点。优点。优点。

【技术实现步骤摘要】
口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，特别涉及一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]口用型无烟气烟草制品通俗称为口含烟，主要包括胶基烟、袋装口含烟、含化烟等，在食品安全检测中，微生物检验有菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测通常按照GB4789.4
‑
2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、GB4789.10
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2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》进行，这些方法中培养为纯人工操作，在菌落形态特征的观察判断上较为依赖经验；检测时间上，阴性结果需要4d，阳性结果需用生化法辅助确认，时间延长到5至7d。另一方面，生化法检测一般采用Biom
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rieux公司的Vitek和Vidas设备，价格分别在80w、60w以上，且仍需人工增菌、分离菌株以保证准确性；检测时间上，阴性结果2d，阳性结果又需用培养法确认。
[0003]基因扩增检测技术相对传统方法大幅缩短时间、节省大量操作。基因扩增检测技术以温控程序区别可粗分为变温、恒温两类，变温技术以PCR为代表，原位检测时间约0.5
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1d、增菌检测约2d。PCR法需建设符合GB/T27403要求实验室，通常需50m2场地、￥30万装修费用；关键仪器PCR仪或qPCR仪的报价在5万或30万以上；离心机、移液器等配套仪器也需上万元；DNA提取、反应液配制、反应条件调节等操作需熟练人员；普通样品检测1
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2个基因，收费约￥300
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500/批次。恒温扩增检测技术如LAMP、HAD、RPA/RAA等具有反应温度单一、不受热循环仪制约的核心特点，其中大多数方法可在一般环境中的普通恒温设备中运行。

技术实现思路

[0004]为了解决现有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测方法对硬件环境要求高、对操作人员的专业要求高，成本高、耗时长的问题。本专利技术提供一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP(环介导等温扩增)检测引物体系、检测试剂盒及检测方法，实现利用LAMP法对口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，检测过程对硬件环境要求不高，检测流程简单，且检测时间快；具有简便高效、结果准确、成本低的优点。
[0005]本专利技术提供了一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系，引物体系包括沙门氏菌23SrRNA引物组、沙门氏菌sseL引物组、金黄色葡萄球菌23SrRNA引物组和金黄色葡萄球菌Coa引物组4组引物组，每组引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP；其中，
[0006]沙门氏菌23SrRNA引物组中，外引物F3如SEQIDNo.1所示，外引物B3如SEQIDNo.2所示，内引物FIP如SEQIDNo.3所示，内引物BIP如SEQIDNo.4所示；
[0007]沙门氏菌sseL引物组中，外引物F3如SEQIDNo.5所示，外引物B3如SEQIDNo.6
所示，内引物FIP如SEQ ID No.7所示，内引物BIP如SEQ ID No.8所示；
[0008]金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组中，外引物F3如SEQ ID No.9所示，外引物B3 如SEQ ID No.10所示，内引物FIP如SEQ ID No.11所示，内引物BIP如SEQ ID No.12 所示；
[0009]金黄色葡萄球菌Coa引物组中，外引物F3如SEQ ID No.13所示，外引物B3如SEQID No.14所示，内引物FIP如SEQ ID No.15所示，内引物BIP如SEQ ID No.16所示。
[0010]采用上述方案，LAMP引物体系根据沙门氏菌23S rRNA与毒力基因sseL，金黄色葡萄球菌23S rRNA与毒力基因Coa设计引物，同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因与rRNA，经验证能有效提高检测准确性；且特异性好、检测灵敏度高。
[0011]本专利技术还提供一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，包括如本专利技术提供的LAMP引物体系；LAMP试剂：适用于引物体系；阳性对照，包括浓度为105copies/μL的沙门氏菌及金黄色葡萄球菌源性DNA，且DNA中包括每组引物组中的F3引物序列和B3引物序列的扩增序列；阴性对照，非靶基因源性DNA；空白对照，三蒸水；反应条件为60～65℃条件下反应20～60min，然后80℃条件下反应10min。
[0012]采用上述方案，建立的口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，可实现对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，并产生肉眼可观测阳性现象。
[0013]根据本专利技术的另一具体实施方式，本专利技术提供的LAMP检测试剂盒，引物体系中每组引物组中各引物的浓度分别为：F3引物2μmol/L、B3引物2μmol/L、FIP引物16μmol/L、 BIP引物16μmol/L。
[0014]LAMP检测试剂盒的反应体系包括：LAMP试剂10μL～15μL，一组引物组1μL，引物组对应的阳性对照、阴性对照、空白对照、样品DNA中的一种1μL。
[0015]根据本专利技术的另一具体实施方式，本专利技术提供的LAMP检测试剂盒，LAMP试剂包括：浓度为20mmol/L的Tris
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HCl、10mmol/L的KCl、10mmol/L的(NH4)2SO4、 6mmol/L的MgCl2、2mmol/L的MgSO4、1.4mmol/L的dNTP、0.1％的Triton X
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100、 1.2mol/L的Betaine。
[0016]LAMP检测试剂盒的快捷试剂的制备方法包括：在反应管中加入LAMP试剂，一组引物组中浓度为1.6μmol/L的FIP和BIP引物、浓度为0.02μmol/L的B3引物和F3引物，8UBst聚合酶，质量体积比为15％海藻糖的三蒸水溶液25μL；冻干后封闭储存于
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20℃的条件下；使用前开启，并加入24μL的三蒸水溶解冻干试剂，再加入阳性对照、阴性对照、空白对照、样品DNA中的一种1μL。
[0017]根据本专利技术的另一具体实施方式，本专利技术提供的LAMP检测试剂盒，反应体系还包括变色剂；检测时，发生变色表明检测结果为阳性，未发生变色表明检测结果为阴性。
[0018]根据本专利技术的另一具体实施方式，本专利技术提供的LAMP检测试剂盒，反应体系还包括荧光DNA染料；检测时，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱为S型扩增曲线表明检测结果为阳性，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱不是S型扩增曲线表明检测结果为阴性。
[0019]根据本专利技术的另一具体实施方式，本专利技术提供的LAMP检测试剂盒，检测时，浊度仪检测扩增值超过阈值时表明检测结果为阳性，浊度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系，其特征在于，所述引物体系包括沙门氏菌23S rRNA引物组、沙门氏菌sseL引物组、金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组和金黄色葡萄球菌Coa引物组4组引物组，每组所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP；其中，所述沙门氏菌23S rRNA引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.1所示，所述外引物B3如SEQ ID No.2所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.3所示，所述内引物BIP如SEQ ID No.4所示；所述沙门氏菌sseL引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.5所示，所述外引物B3如SEQ ID No.6所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.7所示，所述内引物BIP如SEQ ID No.8所示；所述金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.9所示，所述外引物B3如SEQ ID No.10所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.11所示，所述内引物BIP如SEQ ID No.12所示；所述金黄色葡萄球菌Coa引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.13所示，所述外引物B3如SEQ ID No.14所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.15所示，所述内引物BIP如SEQ ID No.16所示。2.一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂盒包括：如权利要求1所述的引物体系；LAMP试剂：适用于所述引物体系；阳性对照，包括浓度为105copies/μL的沙门氏菌及金黄色葡萄球菌源性DNA，且所述DNA中包括每组所述引物组中的F3引物序列和B3引物序列的扩增序列；阴性对照，非靶基因源性DNA；空白对照，三蒸水；反应条件，60～65℃条件下反应20～60min，然后80℃条件下反应10min。3.如权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述引物体系中每组引物组中各引物的浓度分别为：F3引物2μmol/L、B3引物2μmol/L、FIP引物16μmol/L、BIP引物16μmol/L；所述LAMP检测试剂盒的反应体系包括：LAMP试剂10～15μL，一组所述引物组1μL，所述引物组对应的所述阳性对照、所述阴性对照、所述空白对照、样品DNA中的一种1μL。4.如权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂包括：浓度为20mmol/L的Tris
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HCl、10mmol/L的KCl、10mmol/L的(NH4)2SO4、6mmol/L的MgCl2、2mmol/L的MgSO4、1.4mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：董睿，童福强，王维维，张丽，陈永芳，
申请(专利权)人：贵州中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：