检测军团菌属的方法技术

本公开文本提供了用于确定表现出肺炎样症状的患者是否将受益于用抑制军团菌属物种(Legionella sp.)的治疗剂进行的治疗的方法。这些方法是基于检测生物样品中的军团菌属物种和/或嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测军团菌属的方法


[0001]本公开文本提供了用于确定表现出肺炎样症状的患者是否将受益于用抑制军团菌属物种(Legionella sp.)和/或嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的治疗剂进行的治疗的方法。这些方法是基于通过分别测定ssrA基因和16S基因的存在来检测生物样品中的军团菌属物种和嗜肺军团菌。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]下面提供对本公开文本的
技术介绍
的说明只为了帮助读者理解本公开文本，并不承认该说明描述或构成本公开文本的现有技术。
[0003]军团菌(Legionellae)是在土壤和水环境中发现的兼性细胞内革兰氏阴性细菌，在土壤和水环境中它们可以在原生动物内寄生和增殖。结果，它们是人造水系统(包括空调系统、冷却塔和热水浴缸)的常见污染物。军团菌也能够在哺乳动物肺泡巨噬细胞和上皮细胞中复制。一旦雾化，细菌就会进入人体呼吸道，并且引起社区获得性、旅行获得性和医院获得性肺炎。在一些情况下，军团菌会导致军团病(Legionnaires'disease)(一种严重形式的肺炎)或庞蒂亚克热(Pontiac fever)(一种较温和的流感样疾病)。
[0004]目前，军团菌属(Legionella)中有50种已知物种，其包含约70个不同的血清群。嗜肺军团菌血清群1占人类感染的大部分，但是已经报道了该属内超过20种物种的与人类疾病的关联性。鉴定由嗜肺军团菌(L.pneumophila)引起的感染特别重要，因为这种军团菌属物种与导致严重发病率和死亡率的疾病相关。
[0005]培养被认为是检测军团菌的“金标准”。然而，军团菌是生长缓慢且挑剔的生物体。血清学诊断也很常用；然而，血清学诊断只能回顾地进行，很少影响患者的治疗。尿液抗原测试是诊断军团病的快速测试，但是由于其仅检测有限数量的嗜肺军团菌血清群的能力而受到限制。现有的核酸扩增测试易于检测非军团菌属细菌，包括假单胞菌属(Pseudomonas)物种和肠杆菌属(Enterobacter)物种。
[0006]因此，非常需要更稳健、敏感且具特异性的可以快速检测和区分单个生物样品中的军团菌属物种和嗜肺军团菌的方法。

技术实现思路

[0007]本公开文本提供了用于检测和区分单个生物样品中的军团菌属物种和嗜肺军团菌的组合物和方法。在另一个方面，本专利技术技术的方法和组合物可用于为表现出百日咳样症状的受试者选择最佳治疗方案。核酸扩增测试(包括使用实时PCR的测定)是检测临床标本中的军团菌的有吸引力的工具，因为它们能够检测所有军团菌并提供快速结果。这些测试还能够区别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌物种。鉴于在嗜肺军团菌的情况下已经观察到更严重的发病率和死亡率，这是重要的。
[0008]因此，在一些方面，本文提供了用于检测生物样品中至少一种军团菌属物种的存在的方法，所述方法包括以下，由以下组成或基本上由以下组成：(a)提供适于扩增ssrA靶
核酸的第一引物对；提供适于扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对；扩增所述ssrA靶核酸和所述16S rRNA靶核酸，如果存在的话；以及检测在步骤(c)中产生的一种或多种扩增产物；其中所述ssrA靶核酸的存在鉴定出至少一种军团菌属物种的存在，并且所述16S rRNA靶核酸的存在鉴定出嗜肺军团菌的存在。
[0009]在本文提供的方法的一些实施方案中，所述第一引物对包含至少一种简并引物。在一些实施方案中，所述第一引物对包含第一正向引物，所述第一正向引物包含5
’
TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3
’
(SEQ ID NO:1)或其互补体。根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一引物对包含第一反向引物，所述第一反向引物包含5
’
TATGACCGTTGATTCGATACC 3
’
(SEQ ID NO:2)或其互补体。在一些实施方案中，所述第二引物对包含至少一种简并引物。在一些实施方案中，所述第二引物对包含第二正向引物，所述第二正向引物包含5
’
TACCTACCCTTGACATACAGTG 3
’
(SEQ ID NO:4)或其互补体。在一些实施方案中，第二引物对包含第二反向引物，所述第二反向引物包含5
’
CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3
’
(SEQ ID NO:5)或其互补体。
[0010]在一些实施方案中，所述方法还包括使所述生物样品与能够与扩增产物或其互补体特异性杂交的一种或多种寡核苷酸探针接触。在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针是可检测地标记的。在一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯
‑6‑
羧基荧光素、2,7
‑
二甲氧基
‑
4,5
‑
二氯
‑6‑
羧基
‑
荧光素、雅吉瓦黄(Yakima Yellow)、德克萨斯红、TYE 563、ROX、TEX 615、TYE 665、TYE 705和六氯
‑6‑
羧基荧光素。在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针还包含至少一种淬灭剂。在一些实施方案中，所述淬灭剂选自TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针与ssrA扩增产物特异性杂交，并且其中所述寡核苷酸探针包含5
’
TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3
’
(SEQ ID NO:3)或其互补体。在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针与16S rRNA扩增产物特异性杂交，并且其中所述寡核苷酸探针包含5
’
CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3
’
(SEQ ID NO:6)或其互补体。
[0011]在一些实施方案中，所述方法还包括将外源对照DNA与所述生物样品混合。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述生物样品与适于扩增外源对照靶核酸的第三引物对接触，以及扩增所述外源对照靶核酸。在一些实施方案中，所述外源对照靶核酸包含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，所述第三引物对由包含5
’
GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3
’
(SEQ ID NO:17)的第三正向引物和包含5
’
TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3
’
(SEQ ID NO:18)的第三反向引物组成。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述生物样品与第三寡核苷酸探针接触，其中所述第三寡核苷酸探针是可检测地标记的并且包含5
’
TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3
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(SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测生物样品中至少一种军团菌属(Legionella)物种的存在的方法，所述方法包括：(a)提供适于扩增ssrA靶核酸的第一引物对；(b)提供适于扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对；(c)扩增所述ssrA靶核酸和所述16S rRNA靶核酸，如果存在的话；以及(d)检测在步骤(c)中产生的一种或多种扩增产物；其中所述ssrA靶核酸的存在鉴定出至少一种军团菌属物种的存在，并且所述16S rRNA靶核酸的存在鉴定出嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物对包含至少一种简并引物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物对包含第一正向引物，所述第一正向引物包含5
’
TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3
’
(SEQ ID NO:1)或其互补体。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一引物对包含第一反向引物，所述第一反向引物包含5
’
TATGACCGTTGATTCGATACC 3
’
(SEQ ID NO:2)或其互补体。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二引物对包含至少一种简并引物。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二引物对包含第二正向引物，所述第二正向引物包含5
’
TACCTACCCTTGACATACAGTG 3
’
(SEQ ID NO:4)或其互补体。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二引物对包含第二反向引物，所述第二反向引物包含5
’
CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3
’
(SEQ ID NO:5)或其互补体。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述生物样品与能够与扩增产物或其互补体特异性杂交的一种或多种寡核苷酸探针接触。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述寡核苷酸探针是可检测地标记的。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯
‑6‑
羧基荧光素、2,7
‑
二甲氧基
‑
4,5
‑
二氯
‑6‑
羧基
‑
荧光素、雅吉瓦黄、德克萨斯红、TYE 563、ROX、TEX 615、TYE 665、TYE 705和六氯
‑6‑
羧基荧光素。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述寡核苷酸探针还包含至少一种淬灭剂。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述淬灭剂选自TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。14.根据权利要求8
‑
13中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针与ssrA扩增产物特异性杂交，并且其中所述寡核苷酸探针包含5
’
TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3
’
(SEQ ID NO:3)或其互补体。15.根据权利要求8
‑
14中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针与16SrRNA扩增产物特异性杂交，并且其中所述寡核苷酸探针包含5
’
CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3
’
(SEQ ID NO:6)或其互补体。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，所述方法还包括将外源对照DNA与所述生物样品混合。17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括使所述生物样品与适于扩增外源对照靶核酸的第三引物对接触，以及扩增所述外源对照靶核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述外源对照靶核酸包含SEQ ID NO:20。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第三引物对由包含5
’
GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3
’
(SEQ ID NO:17)的第三正向引物和包含5
’
TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3
’
(SEQ ID NO:18)的第三反向引物组成。20.根据权利要求17或18所述的方法，所述方法还包括使所述生物样品与第三寡核苷酸探针接触，其中所述第三寡核苷酸探针是可检测地标记的并且包含5
’
TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3
’
(SEQ ID NO:19)。21.根据权利要求1
‑
20中任一项所述的方法，其中实时PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行的。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法，其中所述生物样品是支气管肺泡灌洗液样品、支气管洗液样品、痰液样品、鼻咽(NP)抽吸物或洗液样品、鼻拭子或细菌分离物。23.一种用于检测生物样品中至少一种军团菌属物种的存在的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)扩增ssrA靶核酸的第一引物对；(b)扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对；(c)能够与所述ssrA靶核酸的区段特异性杂交的第一寡核苷酸探针；以及(d)能够与所述16S rRNA靶核酸的区段特异性杂交的第二寡核苷酸探针；其中所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针是可检测地标记的。24.根据权利要求23所述的试剂盒，所述试剂盒还包含扩增对照靶核酸的第三引物对。25.根据权利要求23或24所述的试剂盒，其中所述第一引物对能够与包含与SEQ ID NO:1或其互补体至少85％
‑
95％相同的核苷酸的ssrA靶核酸特异性杂交。26.根据权利要求23
‑
25中任一项所述的试剂盒，其中所述第二引物对能够与包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少85％
‑
95％相同的核苷酸的16S rRNA靶核酸特异性杂交。27.根据权利要求23
‑
26中任一项所述的试剂盒，其中所述第一引物对包含至少一种简并引物。28.根据权利要求23
‑
27中任一项所述的试剂盒，其中所述第一引物对包含第一正向引物，所述第一正向引物包含5
’
TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3
’
(SEQ ID NO:1)或其互补体。29.根据权利要求23
‑
28中任一项所述的试剂盒，其中所述第一引物对包含第一反向引物，所述第一反向引物包含5
’
TATGACCGTTGATTCGATACC 3
’
(SEQ ID NO:2)或其互补体。30.根据权利要求23
‑
29中任一项所述的试剂盒，其中所述第二引物对包含至少一种简并引物。31.根据权利要求23
‑
30中任一项所述的试剂盒，其中所述第二引物对包含第二正向引物，所述第二正向引物包含5
’
TACCTACCCTTGACATACAGTG 3
’
(SEQ ID NO:4)或其互补体。32.根据权利要求23
‑
31中任一项所述的试剂盒，其中所述第二引物对包含第二反向引物，所述第二反向引物包含5
’
CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3
’
(SEQ ID NO:5)或其互补体。33.根据权利要求23
‑
32中任一项所述的试剂盒，其中所述第一核酸探针包含5
’
TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3
’
(SEQ ID NO:3)或其互补体。34.根据权利要求23
‑
33中任一项所述的试剂盒，其中所述第二核酸探针包含5
’
CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3
’
(SEQ ID NO:9)或其互补体。
35.根据权利要求23
‑
34中任一项所述的试剂盒，其中所述可检测标记是荧光标记。36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯
‑6‑
羧基荧光素、2,7
‑
二甲氧基
‑
4,5
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：奎斯特诊断投资有限责任公司，
类型：发明
国别省市：