一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，其中，所述检测试剂盒包括样本前处理缓冲液、含PGE1的样本激活剂和含PGE1和ADP的样本抑制剂、酶标板、VASP单克隆抗体、显色液、终止液；其中VASP单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠单抗，鼠单抗重链互补决定区包含CDR

【技术实现步骤摘要】
一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于分子免疫学领域。

技术介绍

[0002]人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（VASP）属于Ena/蛋白家族，是一种血小板胞内肌动蛋白调节蛋白。其存在2个重要的磷酸化位点，分别为：丝氨酸157和丝氨酸239，这两个磷酸化位点的磷酸化状态与血小板的活化功能密切相关。丝氨酸157磷酸化位点的磷酸化可以抑制人血小板中纤维蛋白原与糖蛋白IIb/IIIa的结合；丝氨酸239磷酸化位点主要存在于完整的人内皮细胞及血小板上，其磷酸化以应答药理和生理的血管舒张剂和血小板抑制剂。血管舒张刺激磷蛋白是血小板内P2Y12受体特异性活化标志物，抑制其磷酸化；当存在ADP受体拮抗剂时，VASP磷酸化产物增多，进而抑制血小板的活化。
[0003]氯吡格雷对血小板的抑制作用主要通过特异性阻断ADP与血小板膜上P2Y12受体结合而起效，P2Y12受体被抑制则血管舒张刺激磷蛋白磷酸化，表现为血小板抑制；去磷酸化则血小板活性恢复。血管舒张刺激磷蛋白磷酸化是P2Y12活化途径的关键环节，对其量化分析是针对P2Y12通路的特异性检测方法，且测量结果具有良好的稳定性，量化检测血管舒张刺激磷蛋白的磷酸化水平可特异性地评价氯吡格雷对血小板的抑制程度。
[0004]目前，已有部分专利公开了对VSAP抗体的检测专利申请，CN1279691A公开了一种VASP抗体，其特异性结合在239丝氨酸位置磷酸化的VASP，是一种由杂交瘤细胞系DSM ACC2330产生的单克隆抗体。CN108982864A 公开了一种VASP抗体和一种VASP
‑
P(239丝氨酸位置磷酸化的血管扩张型刺激磷蛋白)单克隆抗体。但这些已公开的检测方法前期的制备成本较高，过程较为复杂，不利于规模化工业化生产。因此，本申请设计了一款生产制备成本低，便于规模化生产，检测效果好的VASP检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法。
[0006]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒的技术方案如下：所述试剂盒包括包括：样本前处理缓冲液、含PGE1的样本激活剂和含PGE1和ADP的样本抑制剂、酶标板、VASP单克隆抗体、显色液、终止液、校准品；优选的，所述的VASP单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠单抗，所述鼠单抗包含：a)鼠单抗重链互补决定区，其包含：CDR
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H1、CDR
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H2、CDR
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H3，其中：CDR
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H1具有序列SEQ ID NO 2:VFDYMCK的氨基酸序列，CDR
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H2具有序列SEQ ID NO 3:LGECIHGTNYWAANKG的氨基酸序列，
CDR
‑
H3具有序列SEQ ID NO 4:VSVGYDYAYEA的氨基酸序列；b)鼠单抗轻链互补决定区，其包含：CDR
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L1、CDR
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L2、CDR
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L3，其中：CDR
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L1具有序列SEQ ID NO 5:PNTEDISTS的氨基酸序列，CDR
‑
L2具有序列SEQ ID NO 6:KADDAS的氨基酸序列，CDR
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L3具有序列SEQ ID NO 7:GACSYFNVPIK的氨基酸序列。
[0007]优选的，所述VASP抗体采用如下步骤制备：合成相应的VASP线状DNA作为RNA合成模板，合成线状RNA。将线性RNA 插入环状RNA载体，并分离正确环化的RNA。递送剂和环状RNA肌肉注射小鼠，产生抗体；制备杂交瘤细胞，单克隆测试，扩大细胞培养用于大量生产单克隆抗体。
[0008]优选的，所述的酶标板为VASP单克隆抗体包被的酶标板。
[0009]优选的，所述的VASP单克隆抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的VASP单克隆抗体。
[0010]优选的，所述的显色液为TMB底物显色液；优选的，所述含PGE1的样本激活剂和含PGE1+ADP的样本抑制剂使用时，采用样本前处理缓冲液分别稀释至10μM。
[0011]优选的，所述样本前处理缓冲液为70mM Tris
‑
HCL(PH7.6)、250mM NaCL、0.2% Tween
ꢀ‑
20、0.5％TritonX
‑
100、1.5
‰
Proclin 300，PH为7.6。
[0012]优选的，所述试剂盒还包括人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白校准品。
[0013]更优选的，所述人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白校准品为含20%胎牛血清的20mM Tris缓冲液，工作浓度为400ng/L。
[0014]本专利技术的另一个目的是公开了一种使用上述试剂盒的检测方法。所述方法包括如下步骤：(1)样本前处理：取样本激活剂干粉和样本抑制剂干粉分别用样本前处理剂溶解后，分别取10μl加入等体积待测样本或校准品，混匀，室温孵育10min；(2)将步骤（1）中孵育的激活样本、抑制样本、激活校准品、抑制校准品分别加入酶标板的相应微孔中，孵育；(3)向步骤（2）的相应微孔中加入HRP酶标记的VASP单克隆抗体，避光孵育；(4)洗涤、拍干，每孔加入显色液，避光孵育；(5)每孔加入终止液于450nm测定其吸光度，分别获得激活吸光值C激活，抑制吸光值C抑制，激活校准品和抑制校准品吸光值相同均为C校准；(6)计算血小板反应指数。所述血小板反应指数的计算公式为：血小板反应指数PRI＝[(C激活
‑
C抑制)/（C激活
‑
C校准）]×
100％。
[0015]本专利技术的第三个目的在于公开一种上述人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白ELISA试剂盒的应用，所述试剂盒用于评估抗血小板药物的用药效果。抗血小板药物如氯吡格雷。
[0016]本专利技术的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（VASP）检测试剂盒采用酶联免疫法，测定人体样本中的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白含量，并且对于单抗的序列进行了优化和改进，改进后的单克隆抗体捕获率高，特异性好，克服了全血样本对于检测结果的影响，免去了以往检测前还需要对待测样本本身进行处理的步骤。与目前VASP检测主流技术流式细胞技术相比，对操作人员要求较为简单及仪器费用较低。与ELISA等免疫分析相比，捕获率高，灵敏度高。检测步骤简单、设备要求低，结果稳定可重复，具有良好的推广价值。
附图说明
[0017]图1是本专利技术提供的C激活线性关系；图2是本专利技术提供的C抑制线性关系。
具体实施方式
[0018]下面结合实施例对本专利技术提供的用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括样本前处理缓冲液、含PGE1的样本激活剂和含PGE1和ADP的样本抑制剂、酶标板、VASP单克隆抗体、显色液、终止液；其中VASP单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠单抗，鼠单抗重链互补决定区包含CDR
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H1、CDR
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H2和CDR
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H3片段，鼠单抗轻链互补决定区包含CDR
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L1、CDR
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L2和CDR
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L3片段。2.根据权利要求1所述的用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述CDR
‑
H1具有如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR
‑
H2具有如序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR
‑
H3具有如序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述CDR
‑
L1具有如序列表SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR
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L2具有如序列表SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，CDR
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L3具有如序列表SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板为VASP单克隆抗体包被的酶标板。5.根据权利要求1所述的用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述样本前处理缓冲液为70mM Tris
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HCL、250mM NaCL、0.2% Tween
ꢀ‑
20、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，易倩春，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：