本发明专利技术公开了一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测紫杉醇代谢标志物CYP1B1 432C/G、ABCB1C3435T两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP1B1 432C/G扩增引物、CYP1B1 432C/G测序引物、ABCB1C3435T扩增引物、ABCB1C3435T测序引物和阳性对照。本发明专利技术采用以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对紫杉醇疗效与不良反应预测相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测CYP1B1(432C/G)、ABCB1(C3435T)基因多态性紫杉醇，为临床个性化用药给出基因角度的建议。性化用药给出基因角度的建议。性化用药给出基因角度的建议。
【技术实现步骤摘要】
一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
[0001]本专利技术涉及一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
技术介绍
[0002]紫杉醇，一种天然抗癌药物，紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。微管是真核细胞的一种组成成分，它是由两条类似的多肽(a和p)亚单位构成的微管二聚体形成的。在正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡。紫杉醇可使二者之间失去这种动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合，防止解聚，稳定微管。紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常动态再生，防止正常的有丝分裂纺锤体的形成，导致染色体的断裂，并抑制细胞的复制，从而发挥抗肿瘤作用。以紫杉醇类药物为基础的治疗方案被广泛应用。临床上发现,即使患者接受相同剂量的同种药物,治疗效果和不良反应也会存在明显差异。这种个体间的差异除了与非遗传因素如年龄、器官功能、药物的相互作用等有关外，还与编码药物的代谢酶和药物转运蛋白基因的多态性有关。
[0003]细胞色素P4501B1是细胞色素P450超级因家族成员，其基因转录水平的调控表达主要是经多环芳烃(PAH)诱导激活相关受体，通过芳香烃受体(AhR)复合物发挥作用，CYP1B1与体内甾体类激素的代谢密切相关，可催化17β
‑
雌二醇在位点的羟化作用，导致乳腺癌及其他多种肿瘤的产生。研究表明,CYP1B1 432G基因型mRNA 的表达水平显著增高，CYP1B1的存在可使细胞对多西紫杉醇细胞毒性的敏感性显著降低，增加肿瘤细胞的抗药性。
[0004]多药耐药相关基因ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1) 属于ABC转运蛋白家族中最重要的转运蛋白成员,主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物包括化学物质和药物等主动泵出细胞外。ABCB1基因编码的 P
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糖蛋白是紫杉醇类药物体内转运途径的关键酶。大量研究表明ABCB1基因单核苷酸多态性可能会改变P
‑
糖蛋白的结构,从而影响其功能活性，继而对紫杉醇类药物清除和细胞内外转运过程产生影响,产生个体化差异的化疗反应。ABCBI C3435T基因位点突变会使细胞的外泵功能下降，周围神经毒性增加(紫杉类化疗药物最主要的不良反应之一)这不仅与紫杉醇类诱导的不良反应相关,并且能够影响患者的远期生存。因此，ABCB1基因多态性具有预测紫杉醇类药物化疗效果和不良反应的潜在价值,对于个体化的药物应用具有重要意义。
[0005]目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用 ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方
法。
技术实现思路
[0006]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以多重RPA扩增和焦磷酸测序技术为基础，获得一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
[0008]本专利技术的试剂盒针对CYP1B1(432C/G)、ABCB1(C3435T)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：试剂1～试剂5。
[0009]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0010][0011][0012]优选的，所述CYP1B1(432C/G)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示；所述ABCB1(C3435T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ IDNO:4所示。
[0013]优选的，所述的CYP1B1(432C/G)测序引物、ABCB1(C3435T)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
[0014]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键
骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
[0015]优选的，CYP1B1(432C/G)测序引物对应的测序区域为CYP1B1(432C/G)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；ABCB1(C3435T)测序引物对应的测序区域为ABCB1(C3435T) 待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。
[0016]优选的，CYP1B1(432C/G)和ABCB1(C3435T)共用一个分配指令如序列表SEQ IDNO:9所示。SEQ ID NO:9中“ddA”表示CYP1B1(432C/G)测序反应最后一个加入碱基 ddATP，该碱基的加入可终止该测序反应。SEQ ID NO:9中
“‑”
表示暂停试剂加入3min。该暂停期间会加入ABCB1(C3435T)测序引物。
[0017]优选的，所述的试剂1包括：扩增缓冲液，18mM醋酸镁；
[0018]优选的，所述的试剂2包括：CYP1B1(432C/G)后引物(0.32uM)，CYP1B1(432C/G) 后引物(0.32uM)，ABCB1(C3435T)前引物(0.32uM)，ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)， dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)。
[0019]优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：41℃25min。
[0020]优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的CYP1B1(432C/G)、ABCB1(C3435T) 杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0021]本专利技术还公开了一种采用上述试剂盒的紫杉醇疗效与不良反应预测相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0022]a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用多重RPA扩增进行扩增；
[0023]b.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合；
[0024]c.变性液处理得到单链产物；
[0025]d.加入洗涤缓冲液漂洗；
[0026]e.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
[0027]f.取一个8排管，自圆滑一端向平本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测紫杉醇代谢标志物CYP1B1 432C/G、ABCB1 C3435T两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP1B1 432C/G扩增引物、CYP1B1 432C/G测序引物、ABCB1 C3435T扩增引物、ABCB1 C3435T测序引物和阳性对照。2.根据权利要求1所述的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述CYP1B1 432C/G扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1 C3435T扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。4.根据权利要求1所述的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述CYP1B1 432C/G测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，ABCB1 C3435T测序引物如序列表SEQ ID NO:6所示。5.根据权利要求1所述的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述测序引物为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物。6.根据权利要求1所述的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、18mM醋酸镁、dNTPS、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、结合单链核酸的重组酶和海藻糖。7.根据权利要求6所述的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒中各组分终浓度为：CYP1B1 432...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，易倩春，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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