一种人类CYP2C19基因多态性的引物、探针、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种人类CYP2C19基因多态性引物、探针、试剂盒及其应用，针对G681A检测的特异性引物，针对G636A检测的特异性引物，针对转录上游C‑806T检测的特异性引物，针对内参基因β‑globin检测的特异性引物，以及PCR反应的公用引物。本发明专利技术既增加多重PCR反应的兼容行，也保证了扩增效率的一致性，减少了扩增效率差异导致的结果偏差。

【技术实现步骤摘要】
一种人类CYP2C19基因多态性的引物、探针、试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种人类CYP2C19基因多态性引物、探针试剂盒及其应用属于生物

技术介绍
氯吡格雷(clopidogrel)是心血管疾病中广泛用于抗血小板的药物。血小板激活和聚集是急性冠状动脉综合征和冠状动脉介入(percutaneouscoronaryintervention，PCI)术后引发动脉血栓形成的关键因素。将两种药物氯吡格雷和阿司匹林联用的抗血小板疗法对于急性冠状动脉综合征和PCI术后患者至关重要，可以有效预防缺血事件的发生。然而，接受这种抗血小板疗法的治疗后，仍有约10％的患者发生支架内血栓、死亡、卒中等心血管事件。原因在于不同患者个体对于氯吡格雷的反应存在差异，在众多的影响因素中，基因多态性起着决定性作用。氯吡格雷在人体内通过氧化、水解两步连锁反应后形成一种硫醇衍生物，此衍生物与位于血小板上的二磷酸腺苷(ADP)受体P2Y12不可逆结合，从而阻止ADP对腺苷酸环化酶的抑制作用，促进血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化，从而起到抑制血小板聚集的作用。研究发现氯吡格雷在体内的代谢与人类10号染色体上(10q24.1～10q24.3)编码的CYP2C19有关。CYP2C19属于细胞色素P450同工酶系统，含有450个氨基酸残基，该系统包括同工酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2C19等，其中CYP2C19在上述过程中起主要作用。CYP2C19在自然状态下存在单核苷酸多态性，常见多态性位点有CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G636A)、CYP2C19*17(C-806T)。CYP2C19*2(G681A)会导致转录蛋白的剪切突变失活，CYP2C19*3(G636A)能构成一个终止子，破坏转录蛋白的活性，而CYP2C19*17(C-806T)将会导致CYP2C19转录量增加，增强氯吡格雷代谢能力。CYP2C19基因型的不同组合导致氯吡格雷代谢的个体差异，如CYP2C19*1/*1野生纯合子代表强代谢型(EM)，CYP2C19*1/*2或CYP2C19*1/*3突变杂合子代表中间代谢型(IM)，CYP2C19*2/*2或CYP2C19*3/*3突变纯合子以及CYP2C19*2/*3突变杂合子代表弱代谢型(PM)，CYP2C19*1/*17突变杂合子或CYP2C19*17/*17突变纯合子代表的是超快代谢型(UM)。这些代谢类型的不同会造成药物体内不同的代谢速率，造成不同的药效。因此需要根据CYP2C19基因型来判断不同个体对药物的代谢以及药效、不良反应情况，从而指导用药，达到个体化医疗的目的。目前，用于基因分型的检测方法大体可以分为五种：测序法或称双脱氧末端终止法，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、PCR-膜杂交法、高分辨率溶解曲线法(HRM)、等位基因特异性扩增法(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)。测序法利用PCR对待测片段进行扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对纯化后的PCR产物进行测序，根据测序峰图判读基因型。具有结果准确的优点，是基因多态性位点检测的金标准。但是其成本较高，操作繁琐，试验周期长，限制了其临床使用。近年来发展出纳米孔测序在高精度的基础上降低了检测成本，但该技术尚未成熟且无法摆脱对昂贵仪器的依赖。PCR-RFLP技术同样先得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后根据SNP位点序列选择合适的酶对产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。该方法具有成本低，结果直观的优点。但问题在于多态性位点所在位置没有合适的限制性酶切位点，需要人工引入突变，另外容易造成产物污染，导致假阳性结果，同时操作繁琐，试验周期长。PCR-膜杂交法又称芯片法。首先通过PCR扩增，得到目的SNP位点的PCR产物，然后将PCR产物与固定有特异性探针的纤维素膜杂交，通过比较杂交信号的强度判断样品基因型。能同时检测多个SNP位点，适应高通量的发展方向，但其操作繁琐，需要专业人员；另外结果不好判读，依赖实验人员的经验，容易出现假阳性，且分析过程易导致气溶胶污染。高分辨率溶解曲线法基于实时荧光定量PCR技术平台，通过分析溶解曲线确定产物，而包含SNP位点的PCR产物会出现不同温度的溶解峰，结合溶解峰数目及溶解温度确定SNP基因型。该方法提高了检测通量，消除了ARMS-PCR检测高浓度样本出现假阳性的弊端，检测灵敏成本低，但其引物探针设计复杂，体系优化十分困难，且同一反应体系内的多条引物探针之间相互干扰竞争，不同靶基因之间扩增效率不同，导致漏检。等位基因特异性扩增法或称ARMS-PCR法同样基于实时荧光定量PCR技术平台，使用3`-5`外切酶活性缺失的DNA聚合酶，结合引入突变的引物系统、TaqMAN探针或荧光染料SYBR，能够选择性的扩增特定基因型，通过分析扩增曲线从而分型SNP。该方法的优点是操作简单，试验周期短，成本低廉，PCR产物无需进行后续分析即可判断结果，且整个过程在封闭进行，减少产物交叉污染。目前该方法已成为临床常用的检测方法。该方法主要问题在于检测通量受限于仪器检测通道，若进行SNP分型，其检测通量更要打折。并且在模板浓度过高时，非目标检测基因型也会出现扩增信号，这是由于3`端不完全匹配的引物也存在扩增，且ARMS引物仅仅限速第一轮扩增导致的，一般通过降低引物浓度，调节镁离子浓度及上下游引物比例对检测效果进行优化。降低引物浓度同时能够减少引物二聚体，但限制了检测灵敏度；调节上下游引物比例实验繁琐，不利于降低产品开发成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种CYP2C19基因多态性的检测引物、探针、试剂盒及其应用，具有高灵敏度，高特异性的优点。本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术提供一种人CYP2C19基因多态性的检测引物，所述引物包括:针对G681A检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，针对G636A检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，针对转录上游C-806T检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示，针对内参基因β-globin检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所示，以及PCR反应的公用引物，序列如SEQIDNO.1所示。进一步，本专利技术的人CYP2C19基因多态性的检测引物，还具有这样的特征:其中，所述公用引物的工作浓度为400nmol/L～800nmol/L，特异性引物和特异性探针的工作终浓度分别为20～100nmol/L和80～250nmol/L，内参引物和探针的工作浓度分别为20～100nmol/L、80～250nmol/L。本专利技术还提供一种CYP2C19基因多态性的检测探针，其特征在于：所述探针为针对G68本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人CYP2C19基因多态性的检测引物，所述引物包括:/n针对G681A检测的特异性引物，序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，/n针对G636A检测的特异性引物，序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，/n针对转录上游C-806T检测的特异性引物，序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示，/n针对内参基因β-globin检测的特异性引物，序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，/n以及PCR反应的公用引物，序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人CYP2C19基因多态性的检测引物，所述引物包括:
针对G681A检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，
针对G636A检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，
针对转录上游C-806T检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示，
针对内参基因β-globin检测的特异性引物，序列如SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所示，
以及PCR反应的公用引物，序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性的检测引物，其特征在于:
其中，所述公用引物的工作浓度为400nmol/L～800nmol/L，特异性引物和特异性探针的工作终浓度分别为20～100nmol/L和80～250nmol/L，内参引物和探针的工作浓度分别为20～100nmol/L、80～250nmol/L。


3.一种CYP2C19基因多态性的检测探针，其特征在于：
所述探针为针对G681A检测的特异性探针，序列如SEQIDNO.5所示，
针对G636A检测的特异性探针，序列如SEQIDNO.9所示，
针对C-806T检测的特异性探针，序列如SEQIDNO.13所示，
针对内参基因β-globin检测的特异性探针，序列如SEQIDNO.16所示。


4.一种CYP2C19基因多态性的检测试剂盒，包括：
针对G681A检测的特异性引物和特异性探针、针对G636A检测的特异性引物和特异性探针、以及针对C-806T检测的特异性引物和特异性探针。

【专利技术属性】
技术研发人员：徐阳，宋冬梅，何胜祥，陈林峰，
申请(专利权)人：安徽同科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34