【技术实现步骤摘要】
检测胶质瘤中基因甲基化的方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法。
技术介绍
启动子甲基化是抑癌基因转录沉默最重要、最常见的机制，是肿瘤形成和进展的关键因素。综合胶质瘤多个关键基因MGMT，CDKN2A/P16，TERT启动子甲基化水平，可以辅助胶质瘤的诊断及患者预后的判断。而目前胶质瘤启动子甲基化检测的手段，主要包括甲基化特异性PCR(MSP)，MethyLight，高分辨率溶解曲线(HRM)，结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析(COBRA)，焦磷酸测序等，它们大部分需要重亚硫酸盐处理，过程繁琐，灵敏性低，且花费大。甲基化特异性PCR(MSP)是定性检测方法，只能判断有无甲基化。MethyLight-PCR是在MSP基础上的改进，实现了荧光定量检测，但需要设计荧光探针，花费大，设计繁琐，且在检测过程中容易出现假阳性；亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)需要专业技术人员长时间的分离和转化，需要昂贵的设备，难以推广。焦磷酸测序实现了定量、高通量的检测，但读取长度有限，受到了酶的热不稳定性的...
【技术保护点】
1.一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n(1)用特异性识别和切断未甲基化位点的限制性内切酶处理DNA标准品，获得酶切产物；/n(2)通过PCR扩增所述酶切产物，获得含荧光素的PCR产物；/n(3)将所述PCR产物与阳离子共轭聚合物结合，以使PCR产物发生荧光能量共振转移，并分别检测阳离子共轭聚合物和荧光素的荧光强度；/n(4)根据所述荧光强度计算胶质瘤中基因甲基化水平E值；/n(5)建立甲基化程度定量标准化曲线，确定最优检测条件，并按照步骤(1)-(4)在最优检测条件下对待检测的胶质瘤DNA样品进行检测；/n(6)判定所述胶质瘤DNA样品的...
【技术特征摘要】
1.一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)用特异性识别和切断未甲基化位点的限制性内切酶处理DNA标准品，获得酶切产物；
(2)通过PCR扩增所述酶切产物，获得含荧光素的PCR产物；
(3)将所述PCR产物与阳离子共轭聚合物结合，以使PCR产物发生荧光能量共振转移，并分别检测阳离子共轭聚合物和荧光素的荧光强度；
(4)根据所述荧光强度计算胶质瘤中基因甲基化水平E值；
(5)建立甲基化程度定量标准化曲线，确定最优检测条件，并按照步骤(1)-(4)在最优检测条件下对待检测的胶质瘤DNA样品进行检测；
(6)判定所述胶质瘤DNA样品的甲基化程度，并进行联合分析，以评估胶质瘤CpG岛甲基化表现型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于1ng的以DNA重量计的胶质瘤DNA样品，步骤(1)中所述限制性内切酶的用量为0.01-0.2U；
优选地，步骤(1)中所述限制性内切酶为HpaII；
优选地，所述方法还包括设置不使用所述限制性内切酶处理的空白对照组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中所述PCR扩增分两轮进行；
优选地，第一轮PCR扩增以步骤(1)所得酶切产物作为DNA模板进行，第二轮PCR扩增将荧光素标记的F1-脱氧核糖核苷三磷酸扩增到第一轮PCR扩增的产物中；
更优选地，第二轮PCR扩增后，经碱性磷酸酶处理去除多余的F1-脱氧核糖核苷三磷酸，其中，相对于1ng的以第一轮PCR中DNA模板重量计，碱性磷酸酶的添加量为0.1-0.5U。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，步骤(2)中，PCR扩增的条件使得以下基因中的至少一种得到扩增：MGMT、CDKN2A/P16和TERT。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其中，步骤(2)中，所述PCR扩增中所用的引物包括如下列举的引物(1)-(3)中的一种：
(1)MGMT基因：正向引物5’-CTGTGACAGGAAAAGGTACGGG-3’，反向引物5’-AGTCTGCGCATCCTCGCTG-3’；
(2)CDKN2A/P16基因：正向引物5’-TCCTTCCTTGCCAACGCT-3’，反向引物5’-GCCCCTCCTCTTTCTTCCTC-3’；
(3)TERT基因：正向引物5’-GCGTGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：王树，马立新，刘礼兵，于春江，张宏伟，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，首医大三博脑科医院北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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