快速检测THRA基因突变的引物组以及检测方法技术

本发明专利技术涉及快速检测THRA基因突变的引物组以及检测方法，属于生物技术和医学领域。在THRA基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；本发明专利技术设计了THRA第3号外显子的野生型引物和突变型引物，分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分。与现有技术相比，本发明专利技术方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

【技术实现步骤摘要】
快速检测THRA基因突变的引物组以及检测方法
本专利技术属于生物技术和医学领域，尤其是涉及快速检测THRA基因突变的引物组以及检测方法。
技术介绍
人THRA(ThyroidHormoneReceptorAlpha)基因，定位于人染色体17q21.1的位置。编码蛋白THRA由490个氨基酸组成，分子量约54kDa。THRA蛋白是一个三碘甲状腺原氨酸核激素受体。属于甲状腺激素的几个受体之一，研究表明它介导了甲状腺激素的生物学活力。小鼠敲除实验表明存在几种不同的受体形式，相互之间具有一定的冗余性，可能介导甲状腺激素不同的功能。另外，也有研究报道由不同剪切的转录变体编码不同的同分异构体。THRA基因位点的突变与很多疾病的发生发展相关，包括甲状腺癌、甲状腺功能减退、先天性甲状腺机能低下等，这些位点上的突变是细胞恶性转化及可能的肿瘤产生的预兆，应引起高度重视。因此，关于THRA基因位点突变的检测有着非常重要的作用。众所周知，高分辨熔解曲线(high-resolutionmelt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。而，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸：它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法；使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。SYBRTMGreenI对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。与此同时，罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LCGreen，它有三个优点：1、饱和染料毒性低；2、浓度可以使DNA达到饱和；3、降低了染料位置重组的可能。而，PCR(PolymeraseChainReaction)产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求：仪器：高分辨率高、均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响；试剂：稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线；软件：高分辨率熔解曲线分析专用软件。罗氏荧光定量PCR系统LightCyclerNanoSystem具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。LightCyclerNanoSystem是LightCycler480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等影响因子10分以上5篇，包括Nature,NatureMethods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；第二：耗时长，一般需要2-3天；第三：成本高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；第二：耗时长，一般需要2-3天；第三：成本高。为了解决以上问题，本专利技术提供快速检测THRA基因突变的引物组以及检测方法。本专利技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物以两个突变片段为模板进行PCR扩增，得到突变型模板，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量。高TmG:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。本专利技术的方法灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术首先提供一种快速检测THRA基因突变的引物组，包括THRA第3号外显子(THRA-E3)的野生型引物和突变型引物，野生型引物分别为：THRA-E3F：序列如SEQIDNO.1所示，THRA-E3R：序列如SEQIDNO.2所示；突变型引物分别为THRA-E3K74EF：序列如SEQIDNO.3所示，THRA-E3K74ER：序列如SEQIDNO.4所示。THRA第3号外显子(THRA-E3)的野生型引物和突变型引物具体引物序列如下表所示。表1：THRA-E3的野生型引物和突变型引物的序列引物引物序列(5’-3’)THRA-E3FTCAGAAACAAAAAGTTGAGGGATGGTHRA-E3RGGCTTTAGGTGACATAGGGAGTAATTHRA-E3K74EFGTGAGGGCTGCGAGGTATGGAAGTHRA-E3K74ERCTTCCATACCTCGCAGCCCTCAC本专利技术还提供THRA基因突变的检测方法，包括以下步骤：在THRA基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分；野生型引物分别为：THRA-E3F：序列如SEQIDNO.1所示，THRA-E3R：序列如SEQIDNO.2所示；突变型引物分别为THRA-E3K74EF：序列如SEQIDNO.3所示，THRA-E3K74ER：序列如SEQIDNO.4所示。所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量，高TmG:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm。纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子，纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测THRA基因突变的引物组，其特征在于，包括THRA第3号外显子的野生型引物和突变型引物，/n野生型引物分别为：/nTHRA-E3 F：序列如SEQ ID NO.1所示，/nTHRA-E3 R：序列如SEQ ID NO.2所示；/n突变型引物分别为/nTHRA-E3 K74E F：序列如SEQ ID NO.3所示，/nTHRA-E3 K74E R：序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测THRA基因突变的引物组，其特征在于，包括THRA第3号外显子的野生型引物和突变型引物，
野生型引物分别为：
THRA-E3F：序列如SEQIDNO.1所示，
THRA-E3R：序列如SEQIDNO.2所示；
突变型引物分别为
THRA-E3K74EF：序列如SEQIDNO.3所示，
THRA-E3K74ER：序列如SEQIDNO.4所示。


2.THRA基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
在THRA基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；
不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分；
野生型引物分别为：
THRA-E3F：序列如SEQIDNO.1所示，
THRA-E3R：序列如SEQIDNO.2所示；
突变型引物分别为
THRA-E3K74EF：序列如SEQIDNO.3所示，
THRA-E3K74ER：序列如SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量，
高TmG:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm。


4.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子，纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。


5.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，所述不同比...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭南求，陈林军，钱芝网，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31