【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法及应用。
技术介绍
1、目前，解析小分子药物和蛋白质的相互作用是一个很前沿但很不成熟的领域，小分子药物的靶点蛋白发掘技术需在实践中不断摸索与创新。此外，中医药研究领域，对中药药效的研究相对比较成熟，但是对其直接靶点的探索尚处于起步阶段，因此对中药单体靶点的发掘与鉴定有着迫切的需求。
2、目前探索药物靶点的方法主要包括标记法和非标记法：标记法需标记待研究的药物，例如荧光亲和探针、生物素亲和探针、氢氘交换技术、亲和垂钓技术和噬菌体展示技术等；非标记法则运用了复合物蛋白酶保护现象、复合物热稳定性等原理。然而这些方法具有普遍的问题：步骤复杂，小分子结构的改变或其他分子的加入可能导致非特异性结合，结合不稳定受多种因素影响。比如，氢氘交换是一种用于研究蛋白质结构和动力学的技术，小分子中的氢可以替换成氘，形成氘代小分子，氢和氘的化学性质虽然相似，但氢原子与氘原子的质量差异会对小分子的物理化学性质产生一定影响。常用的氢氘交换技术可以利用这些差异来研究蛋白质和小分子的相互作用，在实验过程中，通常将小分子和蛋白质混合后进行氢氘交换反应，利用质谱等方法检测不同反应时间点的含氘肽段，并计算其含氘量的变化情况，以研究小分子和蛋白质的结合方式和动态过程。在应用该技术时，小分子与蛋白质结合可能会导致肽段的检测不到或动力学不明显，这是因为氢氘交换实验的结果受多种因素影响，包括蛋白质结构、肽段溶解度、蛋白质/配体相互作用等，因此，在进行氢氘交换实验时需要谨慎设计实验并进行科学分析，以减少实
3、黄芩苷能够治疗多种中枢和外周的疾病，包括阿尔茨海默病、急性脑缺血损伤、出血性脑损伤、帕金森病、脊髓损伤、抑郁症、炎症性肠病、呼吸道黏膜慢性炎症性疾病、血液肿瘤、肾损伤、肝损伤、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、肺成纤维细胞增殖、流感病毒致肺纤维化、动脉粥样硬化、缺血性心脑血管疾病、痤疮、牙周炎、青光眼、乳腺癌、宫颈癌、原发性肝癌、胃癌、结肠癌等。此外，黄芩苷在畜禽生产中也具有重要的应用，包括家禽、猪、反刍动物等，黄芩苷对副猪嗜血杆菌感染、牛病毒性腹泻、热应激奶牛、牛肠炎、牛乳房炎、奶牛胚胎着床、鸡大肠杆菌病、雏鸡传染性支气管炎等具有很好的疗效。黄芩苷具有多种药理作用，如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗过敏、神经保护、心肌细胞保护利尿、利胆、解热、降压、镇静、解痉、调节免疫、调节肠道菌群等。然而，黄芩苷在临床中枢和外周疾病以及畜禽疾病中发挥作用的直接作用“靶点”并不清楚，极大地限制了对黄芩苷的理解和应用，这也是目前中医药研究领域最大难点之一，就是发现并确认中药的体内作用“靶点”，即药物在体内的作用结合位点，主要为蛋白质，因此又称“靶点蛋白”。因此，发现并确认黄芩苷的“靶点蛋白”至关重要，阐明其发挥药效的分子机制，将为黄芩苷的应用提供理论基础。
4、中药单体黄芩苷在多种临床疾病以及畜禽疾病中具有治疗作用，但中药单体黄芩苷在脑内发挥作用的靶点蛋白尚不清楚。抑郁症属中医“郁病”范畴，关于抑郁症的病因病机，《灵枢·寿天刚柔》云:“忧恐忿怒伤气，气伤脏，乃病脏”，认为抑郁症的发病多为情志不畅、气机郁滞引起脏腑功能失调。目前多将肝气郁结作为抑郁症的核心病机，临床治疗多从疏肝解郁的方面论治。现今临床上常见的抗抑郁方剂有：疏肝无忧汤、养心解郁汤、柴胡加龙骨牡蛎汤、小柴胡汤、逍遥散、柴芩温胆汤等，这些中药复方中都含有黄芩，配伍柴胡、半夏，三药配比以1:1:1居多，以调畅气机、疏肝解郁，发挥抗抑郁的作用。黄芩来自唇形科植物黄芩的干燥根，味苦，性寒，具有泻火解毒、清热燥湿之功效。一方面，“郁病”之病位主要在肝，肝气郁结最易化火，配伍苦寒之黄芩，以入肝胆经，清肝胆实火；另一方面，“郁病”体内枢机不利，气机失和，气血逆乱，情志不畅，采用柴胡与黄芩升降配伍，柴胡升散、黄芩清降，以和解枢机，调畅气机。故黄芩的功效与中医“郁病”范畴相合，主要作用是清热泻火以解郁除烦、和解枢机以调畅情志。黄芩的主要活性成分是黄酮类化合物，包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，其中黄芩苷具有较强的神经活性和神经保护功能，且抗抑郁活性也最显著。探讨黄芩的主要活性成分黄芩苷干预抑郁症的作用机制非常必要，可为明确中药活性物质基础以及推进中药现代化提供重要的科学依据。黄芩苷能够显著改善慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，cums)诱导的小鼠抑郁样行为。研究发现黄芩苷的代谢产物主要有黄芩苷、黄芩素-6，7-二葡萄糖醛酸苷、黄芩苷甲酯等，其中黄芩苷是主要代谢产物。值得一提的是，口服的黄芩苷不能直接被吸收入血，它需要先在肠道菌群的作用下转化为黄芩苷元,再在小肠粘膜中结合一个葡糖醛酸基复原为黄芩苷后被运至门静脉入血。因此，黄芩苷是一种复原型的天然前体药物。已有研究表明，黄芩苷能够透过血脑屏障，在海马脑区(抑郁症发病密切相关的脑区)通过抗神经炎症、抗氧化、抗凋亡、促进神经发生等机制，继而发挥抗抑郁的作用。然而，黄芩苷在海马脑区的直接作用“靶点”并不清楚，发现并确认黄芩苷在海马脑区的“靶点蛋白”至关重要，阐明其发挥药效的分子机制，将为黄芩苷在抑郁症中的应用提供理论基础。此外，中药靶点蛋白发掘技术的研发，有助于解决中西医结合现代发展面临的瓶颈问题，实现中药靶点研究领域的突破，保护和推动中医药事业的发展，有很好的前景和价值。
5、中国专利cn201410181299.5公开了一种免疫磁珠的制备方法，首先取冷冻干燥过的硅基磁珠分散到极性有机溶剂中超声处理后，加入溶解于该极性有机溶剂中的分散剂，搅拌后，滴加溶解于该极性有机溶剂的带有双端羧基的有机小分子，滴加完毕后反应6～18h；反应结束后，磁分离出羧基磁珠，依次用无水乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液ph值为6～7，超声处理15～30min，分散在万分之二nan3水中，即得到羧基磁珠；羧基磁珠用mes缓冲液清洗至少一次，重悬羧基磁珠于mes缓冲液中，通过活化剂碳二亚胺将磁珠活化后，在mes缓冲液环境中偶联抗体。该专利工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产，但该专利并不是将小分子与免疫磁珠联用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法及应用，本专利技术能够发掘小分子药物(指化学合成药物、天然提取物，包括中药单体)的靶点蛋白的技术。本专利技术运用了免疫磁珠与液质联用(lc-ms/ms)方法，将小分子药物与免疫磁珠链接，免疫磁珠包括氨基磁珠或羧基磁珠，根据小分子的化学结构上活性氨基或羧基基团选择，或将小分子改造接上氨基或羧基基团，若小分子上具有或改造后具有氨基基团，则选择羧基磁珠，若小分子上具有或改造后具有羧基基团，则选择氨基磁珠。然后将小分子-免疫磁珠结合物与特定组织或细胞裂解液孵育，通过免疫磁珠的磁性作用把小分子连同它的靶点蛋白一起垂钓出来，再通过液质联用(lc-ms/ms)技术分析靶点蛋白，步骤简化，小分子结构主体完整，避免非特异性结合。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，步骤S1中，所述免疫磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠；
3.根据权利要求2所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，以中药单体黄芩苷为例，所述黄芩苷靶点蛋白发掘方法的具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，按摩尔质量比，所述黄芩苷：EDCL：DMAP＝1：0.1～0.4：0.1～0.4，
6.根据权利要求4所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，在步骤(5)之后设有步骤(6)：利用分子对接技术得到黄芩苷与靶点蛋白的分子互作及结合位点处的关键氨基酸；
7.根据权利要求6所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，所述黄芩苷与CD11b靶点蛋白结合位点处的关键氨基酸包括Cys-144、Thr-242和Ile-272；
8.一种如权
9.根据权利要求8所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法在研究小分子药物作用机制的应用，其特征在于，所述含中药单体的药物包括治疗临床疾病或畜禽疾病的药物。
10.根据权利要求9所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法在研究小分子药物作用机制的应用，其特征在于，所述临床疾病包括阿尔茨海默病、急性脑缺血损伤、出血性脑损伤、帕金森病、脊髓损伤、抑郁症、炎症性肠病、呼吸道黏膜慢性炎症性疾病、血液肿瘤、肾损伤、肝损伤、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、肺成纤维细胞增殖、流感病毒致肺纤维化、动脉粥样硬化、缺血性心脑血管疾病、痤疮、牙周炎、青光眼、乳腺癌、宫颈癌、原发性肝癌、胃癌和结肠癌；
...【技术特征摘要】
1.一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，步骤s1中，所述免疫磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠；
3.根据权利要求2所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，以中药单体黄芩苷为例，所述黄芩苷靶点蛋白发掘方法的具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，按摩尔质量比，所述黄芩苷：edcl：dmap＝1：0.1～0.4：0.1～0.4，
6.根据权利要求4所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，在步骤(5)之后设有步骤(6)：利用分子对接技术得到黄芩苷与靶点蛋白的分子互作及结合位点处的关键氨基酸；
7.根据权利要求6所述的一种小分子药物靶点蛋白的发掘方法，其特征在于，...
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