【技术实现步骤摘要】
适用于多种EGFR游离DNA检测试剂盒的混合质控包的制备方法
本专利技术属于生物化学
,具体涉及一种适用于多种EGFR游离DNA检测试剂盒的混合质控包的制备方法。
技术介绍
液体活检指通过非侵入性的方式取得人体体液标本(包括血液、尿液、脑脊液、浆膜腔液、唾液等),通过对体液标本中实体组织来源的细胞、核酸、微粒体等的检测,获得其来源组织病理生理信息的检查。狭义的液体活指检针对肿瘤来源的生物学信息的检测,广义的液体活检还包括母体血液中胎儿来源的核酸信息检测,后者已在产前筛查、产前诊断中广泛应用。针对肿瘤的液体活检,因其具有无创,实时动态监测,反应整体肿瘤负荷、分子克隆及克隆转换等信息,在肿瘤的筛查、诊疗决策、疗效评价、复发监测及预后判断等方面日益受到重视,成为近年来肿瘤临床与基础研究的热点方向,其中循环肿瘤DNA更是被认为是新一代标志物的典范。循环肿瘤DNA(ctDNA)是指原位肿瘤、转移灶中凋亡与坏死的细胞释放到外周血中的一类循环DNA。ctDNA半衰期较短,长度在160~200bp,占所有循环DNA的0.1%或更低。目前针对非小细胞肺癌患者,利用高敏感度的检测平台检测外周血EGFR基因敏感或耐药突变已成为临床治疗导则中的重要推荐用以指导抗肿瘤靶向治疗的用药决策。鉴于其具有无创、快速、覆盖信息更为全面等特点,ctDNA检测有广大的临床应用前景。目前针对ctDNA的检测平台包括荧光定量PCR技术,数字PCR技术,二代测序等,为确保不同平台的检测技术均能够给到理想的检测结果,亟需一种全面的临床 ...
【技术保护点】
1.一种适用于多种EGFR游离DNA检测试剂盒的混合质控包的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:/n(1)包含EGFR 18-21外显子片段的质粒构建、转化及提取/n(1-1)序列检索,根据不同的突变类型在相应的区域对于碱基进行修正以获得包含合成目的片段;/n(1-2)目的片段与质粒的连接;/n(1-3)转化;/n(1-4)质粒抽提和琼脂糖凝胶电泳的纯化;/n(2)核酸的片段化/n(2-1)使用非接触式超声波破碎仪,完成步骤(1-2)中质粒的片段化,获得长度为160~180bp的片段,使用片段分析仪对超声后的碎片化DNA进行片段长度分析,确认碎片化的成果;/n(2-2)使用非接触式超声波破碎仪完成对人来源肝癌细胞系Hu7,获得长度为160~180bp的片段,使用片段分析仪对超声后的碎片化DNA进行片段长度分析,确认碎片化的成果,该模板模拟人血浆cfDNA,作为本混合质控包的背景核酸;/n(3)EGFR混合质控包的配置/n(3-1)通过公式转换计算理论预配置的质粒中包含的目的拷贝数,计算公式如下:6.02*10
【技术特征摘要】
1.一种适用于多种EGFR游离DNA检测试剂盒的混合质控包的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)包含EGFR18-21外显子片段的质粒构建、转化及提取
(1-1)序列检索,根据不同的突变类型在相应的区域对于碱基进行修正以获得包含合成目的片段;
(1-2)目的片段与质粒的连接;
(1-3)转化;
(1-4)质粒抽提和琼脂糖凝胶电泳的纯化;
(2)核酸的片段化
(2-1)使用非接触式超声波破碎仪,完成步骤(1-2)中质粒的片段化,获得长度为160~180bp的片段,使用片段分析仪对超声后的碎片化DNA进行片段长度分析,确认碎片化的成果;
(2-2)使用非接触式超声波破碎仪完成对人来源肝癌细胞系Hu7,获得长度为160~180bp的片段,使用片段分析仪对超声后的碎片化DNA进行片段长度分析,确认碎片化的成果,该模板模拟人血浆cfDNA,作为本混合质控包的背景核酸;
(3)EGFR混合质控包的配置
(3-1)通过公式转换计算理论预配置的质粒中包含的目的拷贝数,计算公式如下:6.02*1023*质粒浓度×10-9/DNA长度×660;
(3-2)采用梯度稀释的方法,将模板稀释到目的浓度以构成需要的质控品,目标浓度为1%;
(3-3)完成上述步骤的稀释过程,获得理论突变丰度为1%的样本,使用血浆EGFRSuperARMs检测试剂盒完成对上述样本的定性检测以验证结果的准确度;
(3-4)使用自建的数字PCR检测系统完成对不同突变的准确定值;
(3-5)同时使用IlluminaNGS检测系统完成对上述样本的二次定值;
(3-6)根据突变丰度的计算公式获得1%的EGFR混合质控包。
2.根据权利要求1所述的适用于多种EGFR游离DNA检测试剂盒的混合质控包的制备方法,其特征在于,步骤(1-2)的具体步骤为:
(1-2-1)建立连接反应体系,包括目的片段2~5μl、载体pUC57-Amp0.5~3μl、连接用反应液3~7μl、T4连接酶0.5~3μl;
(1-2-2)将步骤(1-2-1)中的连接反应体系混匀后,16℃连接30m...
【专利技术属性】
技术研发人员:袁嘉扬,
申请(专利权)人:苏州艾可瑞斯生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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