一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种ApoA‑II、ApoC‑II检测混合质控品，为包括三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000、ProClin 950、去激素血清和ApoA‑II、ApoC‑II两种蛋白阳性物质的冻干品。所述的ApoA‑II、ApoC‑II检测混合质控品的制备方法包括如下步骤：(1)制备人ApoA‑II、ApoC‑II基因克隆与表达载体；(2)利用80L发酵罐大规模发酵表达rhApoA‑II、rhApoC‑II；(3)rhApoA‑II、rhApoC‑II的纯化；(4)ApoA‑II、ApoC‑II蛋白质控品的的配制、赋值与分装。本发明专利技术使用真核细胞体系制备的ApoA‑II、ApoC‑II检测混合质控品稳定性好、成本低，使用简便、有利于动物实验的使用，不受运输、温度因素影响，检测重复性好，稳定性高，能满足临床对ApoA‑II、ApoC‑II检测的质量控制要求，可以提高临床样本检测结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品及其制备方法
本专利技术涉及一种检测质控品，具体涉及一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品及其制备方法。
技术介绍
载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用的蛋白质。大量研究发现载脂蛋白基因发生突变，形成不同等位基因型多态性，并进一步形成不同表型的载脂蛋白，可影响血脂代谢和利用，从而影响高脂血症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病等的发生和发展。载脂蛋白主要分A、B、C、D、E五类，基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能。主要在肝(部分在小肠)合成，按ABC系统命名，各类又可细分几个亚类，以罗马数字表示。载脂蛋白是构成血浆脂蛋白的重要组分，赋予脂类以可溶的形式，而且在血浆脂蛋白代谢中起重要作用：(1)促进脂类运输；(2)调节酶活性；(3)引导血浆脂蛋白同细胞表面受体结合，是功能上极其活跃的一组血浆蛋白质。ApoA-II是HDL中第二种含量多的载脂蛋白，在HDL2占载脂蛋白的15％，在HDL3中占载脂蛋白的25％。CM中达总载脂蛋白的7％～10％，VLDL中也少量存在。直到1985年，ApoA-II蛋白质的氨基酸序列、cDNA序列及基因序列均已阐明。ApoA-II是由两条多肽链的77个氨基酸残基组成。ApoA-II在不加还原剂的SDS-PAGE中测出分子量是17000D，在人血浆中以二聚体形式存在。ApoA-II的单体分子量为8700D。人ApoA-II蛋白C端氨基酸残基为谷氨酸，N端为吡咯烷酮酸，缺乏组氨酸，精氨酸及色氨酸。ApoA-II有多态性存在，最主要的多态型等电点为4.9，而含量较少的多态型的等电点为5.17、4.68、4.42和4.20。载脂蛋白C是极低密度脂蛋白胆固醇的主要载脂蛋白，也存在于高密度脂蛋白-胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇中，有3种不同的载脂蛋白C，即ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III，它是CM、VLDL他和HDL的少量结构蛋白。目前，ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品具有如下缺点：稳定性差、成本高，使用不方便，不利于动物实验的使用，检测重复性差，临床样本检测结果准确性差。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品及其制备方法，稳定性好、成本低，使用简便、有利于动物实验的使用，不受运输、温度因素影响，检测重复性好，能满足临床对ApoA-II、ApoC-II检测的质量控制要求，可以提高临床样本检测结果的准确性。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，为包括去激素血清和ApoA-II、ApoC-II两种蛋白阳性物质的冻干品。其中，所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品还包括三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000和ProClin950。优选的，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度≥99.9％。本专利技术还提供一种上述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品的制备方法，包括如下步骤：(1)制备人ApoA-II、ApoC-II基因克隆与表达载体；(2)利用80L发酵罐大规模发酵表达rhApoA-II、rhApoC-II；(3)rhApoA-II、rhApoC-II的纯化；(4)ApoA-II、ApoC-II蛋白质控品的的配制、赋值与分装。其中，步骤(1)包括如下步骤：(1-1)Trizol方法从人肝组织中提取总RNA，将新鲜分离的人肝组织切成100mg的大小，立即放入液氮；取出冰冻的组织300mg进行研磨，将碾碎组织转移至50ml离心管中，加入5mlTrizol，室温使用匀浆器高速匀浆15-30sec，加入1.0ml氯仿，充分震荡摇匀，室温下放置5min，4℃离心(12000rpm/min)15min；将上层水相移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，震荡摇匀，沉淀10min，4℃离心(12000rpm/min)15min弃上清，加入75％乙醇1ml洗涤沉淀，4℃离心(12000rpm/min)5min，将总RNA沉淀溶于50ulDEPC处理过的水中，-80℃保存备用；(1-2)将抽提完的RNA取1ug，1ulOligodT，70℃变性10min，冰浴1min，然后加入下列反应液体：于PCR仪上42℃反应60min，95℃灭活5min，合成cDNA用于下列反应：根据Genebank中已发表的人ApoA-II、ApoC-II基因设计引物，poA-II-F：ATGAAGCTGCTCCAGCAACTGT；ApoA-II-R：TTATCACTGGGTGGCAGGCTGT；ApoC-II-F：TCCAGCAGCAAGATTCAGAGTGCC；ApoC-II-R：TGGGATGTCACCCTTCAGGGTC；反应体系为：按照下列PCR扩增程序扩增：①94℃2min；②94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，30个循环；③72℃10min；将PCR产物进行1％琼脂糖电泳，紫外灯下切下目的片段，并使用DNA回收试剂盒进行回收；(1-3)回收后的ApoA-II、ApoC-II基因片段与T载体16℃连接过夜，连接反应体系如下：最终获得重组克隆质粒pMD18-T-ApoA-II、pMD18-T-ApoC-II；(1-4)XL1-Blue感受态细胞的制备(1-4-1)挑取单个菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜，取lml菌液接种于含有100mlLB培养基的1L培养瓶中，37℃、250r/min震荡培养3h；(1-4-2)4℃离心(4000r/min)10min收集细胞；(1-4-3)倒出培养液，将管倒置1min以使培养液流尽；(1-4-4)用60ml预冷过的0.1mol/LCaCl2-MgCl2重悬细胞；(1-4-5)4℃离心(4000r/min)10min，回收细胞；(1-4-6)加入140ulDMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min；(1-4-7)再加入140ulDMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min，每管100ul无菌分装，-80℃冻存；(1-5)重组质粒的转化(1-5-1)取一管冻存的感受态细胞冰上融化，加入上述连接产物，轻轻混匀；(1-5-2)冰浴30min；(1-5-3)将反应管放入42℃水浴中，热激90s；(1-5-4)向管中加入800ul预热的SOC培养基，将管转移到摇床上震荡培养(225r/min)1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；(1-5-5)取200ul已转化的感受态细胞涂布于含Amp(100ug/ml)的LB平板培养基上，室温放置直至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，为包括去激素血清和ApoA-II、ApoC-II两种蛋白阳性物质的冻干品。/n

【技术特征摘要】
1.一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，为包括去激素血清和ApoA-II、ApoC-II两种蛋白阳性物质的冻干品。


2.根据权利要求1所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，还包括三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000和ProClin950。


3.根据权利要求2所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度≥99.9％。


4.一种如权利要求1-3中任一项所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备人ApoA-II、ApoC-II基因克隆与表达载体；
(2)利用80L发酵罐大规模发酵表达rhApoA-II、rhApoC-II；
(3)rhApoA-II、rhApoC-II的纯化；
(4)ApoA-II、ApoC-II蛋白质控品的的配制、赋值与分装。


5.根据权利要求4所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)Trizol方法从人肝组织中提取总RNA，将新鲜分离的人肝组织切成100mg的大小，立即放入液氮；
取出冰冻的组织300mg进行研磨，将碾碎组织转移至50ml离心管中，加入5mlTrizol，室温使用匀浆器高速匀浆15-30sec，加入1.0ml氯仿，充分震荡摇匀，室温下放置5min，4℃离心15min；
将上层水相移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，震荡摇匀，沉淀10min，4℃离心15min弃上清，加入75％乙醇1ml洗涤沉淀，4℃离心5min，将总RNA沉淀溶于50ulDEPC处理过的水中，-80℃保存备用；
(1-2)将抽提完的RNA取1ug，1ulOligodT，70℃变性10min，冰浴1min，然后加入下列反应液体：






于PCR仪上42℃反应60min，95℃灭活5min，合成cDNA用于下列反应：
根据Genebank中已发表的人ApoA-II、ApoC-II基因设计引物，
poA-II-F：ATGAAGCTGCTCCAGCAACTGT；
ApoA-II-R：TTATCACTGGGTGGCAGGCTGT；
ApoC-II-F：TCCAGCAGCAAGATTCAGAGTGCC；
ApoC-II-R：TGGGATGTCACCCTTCAGGGTC；
反应体系为：



按照下列PCR扩增程序扩增：
①94℃2min；
②94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，30个循环；
③72℃10min；
将PCR产物进行1％琼脂糖电泳，紫外灯下切下目的片段，并使用DNA回收试剂盒进行回收；
(1-3)回收后的ApoA-II、ApoC-II基因片段与T载体16℃连接过夜，连接反应体系如下：






最终获得重组克隆质粒pMD18-T-ApoA-II、pMD18-T-ApoC-II；
(1-4)XL1-Blue感受态细胞的制备
(1-4-1)挑取单个菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜，取lml菌液接种于含有100mlLB培养基的1L培养瓶中，37℃、250r/min震荡培养3h；
(1-4-2)4℃离心10min收集细胞；
(1-4-3)倒出培养液，将管倒置1min以使培养液流尽；
(1-4-4)用60ml预冷过的0.1mol/LCaCl2-MgCl2重悬细胞；
(1-4-5)4℃离心10min，回收细胞；
(1-4-6)加入140ulDMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min；
(1-4-7)再加入140ulDMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min，每管100ul无菌分装，-80℃冻存；
(1-5)重组质粒的转化
(1-5-1)取一管冻存的感受态细胞冰上融化，加入上述连接产物，轻轻混匀；
(1-5-2)冰浴30min；
(1-5-3)将反应管放入42℃水浴中，热激90s；
(1-5-4)向管中加入800ul预热的SOC培养基，将管转移到摇床上震荡培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；
(1-5-5)取200ul已转化的感受态细胞涂布于含Amp的LB平板培养基上，室温放置直至液体被吸收，37℃倒置培养12h-16h；
(1-6)rhApoA-I毕赤酵母分泌型表达载体的构建
(1-6-1)根据GenBank已发表的hApoA-IDNA序列，设计引物，扩增5’端引入Xhol限制性内切酶位点和Kex2蛋白酶识别序列编码基因，3’端引入Xbal限制性内切酶位点的ApoA-II、ApoC-II编码序列；
上游引物：31bp
5’-AAACTCGAGAAGAGAGATGAACCCCCCCAGA-3’；
下游引物：32bp
5’-GCGTCTAGATCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3’；
(1-6-2)PCR反应
按下述比例在0.2mlEP管中建立PCR反应体系：



在PCR仪上进行循环扩增，扩增程序为：
①94℃4min；
②94℃30s，61℃30s，72℃1min，30个循环；
③72℃10min；
扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因；
(1-7)pPICZa-hApoA-II、pPICZa-hApoC-II分泌型表达载体构建
构建表达载体的PCR上、下游引物中分别设计有Xhol和Xbal酶切位点，供基因重组到载体pPICZa相应的内切酶部位；
用Xhol和Xbal消化目的基因hApoA-I和载体pPICZa，回收酶切产物，16℃连接过夜；
(1-8)酵母感受态的制备
(1-8-1)取毕赤酵母X-33菌种，于不含抗生素的YPD阴性培养板划线培养，30℃、2～3d；待菌落长至2～3mm，挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，225r/min、30℃震荡培养24h；
(1-8-2)取其中200ul菌液接种于200mlYPD培养基中，250r/min、30℃震荡培养过夜；
(1-8-3)4℃离心5min，收集细胞；
(1-8-4)倒出培养液，将管倒置1min使培养液流干；
(1-8-5)用200ul预冷过的超纯水重悬细胞，4℃离心，弃上清；
(1-8-6)用20ml预冷过的1mol/LD-山梨醇重悬细胞，4℃离心5min，弃上清；
(1-8-7)用300ul预冷过的1mol/LD-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，置于冰上，当天使用；
(1-9)转化
(1-9-1)取80ul酵母感受态细胞，与10～15ul上述线性化的重组质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min；
(1-9-2)擦干水汽，...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁嘉扬，吴炯，戴谦，
申请(专利权)人：苏州艾可瑞斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32