基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种基于CRSIPR‑Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品，用于全方位监控融合基因检测的过程。制备步骤如下：(1)利用CRISPR‑Cas9敲入技术构建带有EML4‑ALK、CD74‑ROS1融合基因特定融合位点的单克隆性HBE细胞株；(2)应用步骤(1)中基因编辑成功的单克隆性HBE细胞株结合对照野生型细胞株构建小鼠皮下移植瘤模型；等待肿瘤成长至1cm

【技术实现步骤摘要】
基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品及其制备方法
本专利技术属于肺癌融合基因核酸检测领域，尤其涉及一种基于组织微阵列与CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品及其制备方法。
技术介绍
肺癌是我国当前发病率最高的恶性肿瘤，也是引起肿瘤相关死亡的最主要肿瘤类型。据预测，到2025年我国每年肺癌新发病例将突破100万。因此，肺癌的诊疗已成为我国癌症研究领域一场迫在眉睫的“攻坚战”。非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)是肺癌最常见的类型，占到所有肺癌的85％以上。现有研究表明，ROS1、ALK融合基因是中国NSCLC人群的全新驱动基因，约占到全部NSCLC患者的10％，其检测对于应用新型抑制剂具有重要指导作用。然而，目前肺癌融合基因检测质量控制情况令人堪忧，解决此窘境的有效且关键性途径即为提供一种可覆盖多种检测方法的质控品。目前肺癌融合基因质控品主要有两大类，一类为阳性病人肿瘤组织的切片、另一类是人工制备的仿肺癌组织。阳性患者肿瘤组织切片存在严重伦理问题，且阳性率不可控，批间差大等缺陷，目前已逐渐被淘汰。既往的人工制备仿肺癌组织尽管较好的解决了患者来源质控品的大部分弊端，但是还是存在诸多缺点：首先，组织来源多为293T等工具细胞，本身并不是癌细胞，在整体基因组与转录组方面与实际肺癌细胞存在大量差异；其次，质控品的融合基因发生率变异范围较大，尤其在低丰度水平；最后，整体流程较为复杂，难以转化至实际大批量的工业生产中。因此，探索新型、价格低廉、技术门槛低的方式制备非小细胞肺癌融合基因检测质控品对于规范肺癌融合基因检测，确保其准确性具有重要意义。组织微阵列，亦称为组织芯片，由生物芯片发展延伸而来的一种特殊的生物芯片技术，是生物芯片重要的组成部分。基本原理为是多个不同个体组织标本以有序、互不干扰的阵列方式规则的排布于同一载体上，方便进行同一指标的原位组织学研究。组织微阵列具有下述特点：信息量大、一次性可获得大量结果、实验整体误差小、便捷且成本低廉，易于标准化生产。故应用组织微阵列方式进行非小细胞肺癌融合基因质控生产可有效规避既往产品的弱点。CRISPR-Cas9是目前已成为生物工程领域中最常用的基因编辑工具。近年来，随着技术研发的进展，以CRIPSR-Cas9技术为基础的大片段敲入表达已成为现实。相较于普通的质粒表达体系，其具有更高的表达效率与更低的错误发生率，可稳定维持特定基因的高效、持久表达，故尤其适合用于构建需要稳定比例的肺癌融合基因质控品。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品及其制备方法，结合精准基因编辑技术与精确定量的组织微阵列技术，可对现有肺癌融合基因检测过程中的突变评率有效覆盖，样本来源与实际肿瘤组织高度类似；整体制备流程简便，成本低，易储存与转运，具有良好应用前景。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品，其特征在于，用于全方位监控融合基因检测的过程。本专利技术还提供一种基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品的制备方法，包括如下步骤：(1)利用CRISPR-Cas9敲入技术构建带有EML4-ALK、CD74-ROS1融合基因特定融合位点的单克隆性HBE细胞株；(2)应用步骤(1)中基因编辑成功的单克隆性HBE细胞株结合对照野生型细胞株构建小鼠皮下移植瘤模型；等待肿瘤成长至1cm3后处死模型小鼠，收集肿瘤组织，预处理后固定，石蜡包埋；(3)利用步骤(2)收集的肿瘤组织，按照一定突变/野生比例构建病例组织切片微阵列，得到不同融合频率的肺癌融合基因核酸检测质控品。其中，步骤(1)的具体步骤为：根据CD74-ROS、EML4-ALK融合区域设计特异性引物，扩增相关片段产物全长可覆盖融合位点，完成扩增整合后，插入两段各带有800bp同源臂的表达供者质粒，分别向受体HBE细胞导入CRISPR/Cas9和供者序列，构建带有EML4-ALK、CD74-ROS1融合基因特定融合位点的单克隆性HBE细胞株。其中，步骤(2)的具体步骤为：(2-1)编辑后HBE细胞的准备对步骤(1)中完成CRISPR/Cas9敲入细胞编辑的HBE细胞扩增保种后，取HBE细胞通过流式细胞术、PI染色、以及CCK-8实验检测细胞凋亡与增殖活性，确定细胞处于对数生长期后，计数HBE细胞并使用无血清DMEM培养液将HBE细胞重悬至2x106个细胞/ml，体积为100μl；之后使用原始浓度的MatriGel基质胶100μl与前述的细胞悬液按照体积比1:1的比例进行混匀，置于冰上备用；对照野生型细胞同样按照上述操作准备，置于冰上备用；(2-2)HBE来源皮下移植瘤模型的构建以裸鼠作为基础荷瘤动物，利用1ml注射器将步骤(2-1)中敲入表达特定融合基因的HBE细胞及其对应对照组HBE细胞小心注入裸鼠前肢肩胛骨上方，待形成肉眼可见隆起后，小心退针；对针道进行按压防止注入肿瘤细胞悬液外漏；对穿刺点进行碘伏消毒，防止感染；每种细胞接种10只裸鼠，构建皮下异种来源移植瘤模型；待肿瘤增殖至1cm3时，处死皮下移植瘤小鼠，无菌条件取出肿瘤组织，剔除坏死部分后将组织分为两份，其中一份冻存于-80℃用于验证体内肿瘤的融合基因敲入表达情况；另外一半则使用4％多聚甲醛进行固定后，置于4℃环境待后续石蜡包埋及组织微阵列芯片产品构建。其中，步骤(3)的具体步骤为：采用细针打孔的方法，从步骤(2)的包埋蜡块中取得目标组织，其后将所有目标组织统一点样于同一载玻片上，构建组织芯片；具体流程如下：(3-1)选取待研究的组织；(3-2)利用HE对组织进行染色，通过显微镜观察，选取肿瘤增殖最为活跃、实质细胞密度最高、凋亡程度最低的区域作为候选组织区域；(3-3)使用记号笔标记出待研究的区域，使用组织芯片点样仪将标记好的组织按设计排列在空白蜡块上；(3-4)使用切片机对阵列蜡块进行连续切片即获得组织芯片；(3-5)为达到制定融合基因比例的目的，将敲入表达组织与野生型组织按照既定比例混合，共同点样于载玻片，构建病例组织切片微阵列，得到不同融合频率的肺癌融合基因核酸检测质控品。本专利技术还提供一种利用上述的制备方法制备的基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品的准确性鉴定方法，实验步骤为：使用数字PCR技术对不同比例融合基因质控进行检测，鉴定其准确性。本专利技术还提供一种利用上述的制备方法制备的基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品的重复性鉴定方法，实验步骤为：使用数字PCR技术对三个不同批次制备的全水平0，0.1％，0.5％，1.0％，5％融合基因质控产品进行检测，鉴定不同批次产品的重复性。本专利技术还提供一种利用上述的制备方法制备的基于CRSIPR-Cas9技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品，其特征在于，用于全方位监控融合基因检测的过程。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品，其特征在于，用于全方位监控融合基因检测的过程。


2.一种基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用CRISPR-Cas9敲入技术构建带有EML4-ALK、CD74-ROS1融合基因特定融合位点的单克隆性HBE细胞株；
(2)应用步骤(1)中基因编辑成功的单克隆性HBE细胞株结合对照野生型细胞株构建小鼠皮下移植瘤模型；等待肿瘤成长至1cm3后处死模型小鼠，收集肿瘤组织，预处理后固定，石蜡包埋；
(3)利用步骤(2)收集的肿瘤组织，按照一定突变/野生比例构建病例组织切片微阵列，得到不同融合频率的肺癌融合基因核酸检测质控品。


3.根据权利要求2所述的基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：
根据CD74-ROS、EML4-ALK融合区域设计特异性引物，扩增相关片段产物全长可覆盖融合位点，完成扩增整合后，插入两段各带有800bp同源臂的表达供者质粒，分别向受体HBE细胞导入CRISPR/Cas9和供者序列，构建带有EML4-ALK、CD74-ROS1融合基因特定融合位点的单克隆性HBE细胞株。


4.根据权利要求2所述的基于CRSIPR-Cas9技术的肺癌融合基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：
(2-1)编辑后HBE细胞的准备
对步骤(1)中完成CRISPR/Cas9敲入细胞编辑的HBE细胞扩增保种后，取HBE细胞通过流式细胞术、PI染色、以及CCK-8实验检测细胞凋亡与增殖活性，确定细胞处于对数生长期后，计数HBE细胞并使用无血清DMEM培养液将HBE细胞重悬至2x106个细胞/ml，体积为100μl；之后使用原始浓度的MatriGel基质胶100μl与前述的细胞悬液按照体积比1:1的比例进行混匀，置于冰上备用；对照野生型细胞同样按照上述操作准备，置于冰上备用；
(2-2)HBE来源皮下移植瘤模型的构建
以裸鼠作为基础荷瘤动物，利用1ml注射器将步骤(2-1)中敲入表达特定融合基因的HBE细胞及其对应对照组HBE细胞小心注入裸鼠前肢肩胛骨上方，待形成肉眼可见隆起后，小心退...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁嘉扬，吴炯，马晓路，
申请(专利权)人：苏州艾可瑞斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32