一种非小细胞肺癌诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种诊断试剂盒，尤其是一种非小细胞肺癌诊断试剂盒；属于诊断试剂盒技术领域。一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，试剂盒含有miR‑4286的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：SEQ ID NO：1上游引物序列：5'‑GCGTCACCCCACTCCT‑3'；SEQ ID NO：2通用下游引物序列：5'‑CGCTCACCCCACTCCT‑3'。本发明专利技术提供的试剂盒通过检测miR‑4286的表达，可以对非小细胞肺癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。

【技术实现步骤摘要】
一种非小细胞肺癌诊断试剂盒
本专利技术涉及一种诊断试剂盒，尤其是一种非小细胞肺癌诊断试剂盒；属于诊断试剂盒

技术介绍
公开号为CN102121047A的中国专利技术专利，公开了一种中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒是基于对中期因子（MK）的研究，而发展起来的一种诊断手段。多项有关MK功能的研究证实其参与肿瘤的生长、分化及肿瘤血管生成等过程，表明MK在肿瘤演化过程中可能具有直接作用。由于MK特异表达于多种肿瘤组织，因而MK成为肿瘤治疗的新靶点。然而，MK因子与多种肿瘤都相关，仅通过该试剂盒不能很好地对肿瘤进行分型。而非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位于世界之首，侵袭、转移是其致死的主要原因，但其转移的机制一直未能阐明。微小RNA（microRNAs,miRNAs）被认为通过作用于癌基因和抑癌基因的转录后调控在NSCLC的发生、转移中起着重要的作用。miR-4286是一个在人胚胎干细胞早期分化进程中筛选出的新发现的miRNA，在黑色素瘤、食管癌及直肠癌的治疗中可观察到miR-4286表达的上调或显著改变。但目前，仍未有基于该发现的非小细胞肺癌诊断试剂盒的报导。
技术实现思路
本专利技术要解决上述技术问题，从而提供一种非小细胞肺癌诊断试剂盒。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，试剂盒含有miR-4286的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：SEQIDNO：1上游引物序列：5'-GCGTCACCCCACTCCT-3'；SEQIDNO：2通用下游引物序列：5'-CGCTCACCCCACTCCT-3'。作为优选，所述试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂；所述试剂包括：组织总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、逆转录试剂和定量PCR试剂；其中，逆转录试剂包括miR-4286的特异逆转录引物，其序列为：SEQIDNO：3引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGTACC-3'；逆转录试剂还包括内参U6的逆转录引物，其序列为：SEQIDNO：4引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；定量PCR试剂中还包括miR-4286相关的内参U6的特异引物，其序列为：SEQIDNO：5上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3'；SEQIDNO：4通用下游引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。我们的研究中采用miRNA芯片技术筛选NSCLC组织中特异性表达的miRNA，通过聚类分析发现，miR-4286在发生淋巴结转移的NSCLC组织中特异性上调表达，此后Real-TimePCR技术验证证实，NSCLC癌组织中miR-4286的上调表达与淋巴结转移密切相关。进一步的采用原位杂交方法和荧光定量PCR方法分别检测NSCLC组织芯片和新鲜冻存组织中miR-4286的表达，分析其表达水平与NSCLC临床病理特征的关系。组织芯片中NSCLC癌组织的miR-4286阳性表达率为62.14%，明显高于癌旁配对正常组织的4.29%（P<0.001)；癌组织中miR-4286的表达与NSCLC的肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P<0.05），而与患者的性别、年龄、肿瘤组织类型、分化程度均无明显的相关性(P>0.05)。荧光定量PCR方法结果显示，NSCLC癌组织中miR-4286的表达水平为0.032(0.024-0.057)，显著高于配对癌旁正常组织的0.027(0.018-0.041)（P<0.05)，miR-4286的高表达水平与NSCLC的TNM分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。NSCLC组织中miR-4286的高表达与NSCLC的疾病进展与转移潜能明显相关。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的试剂盒通过检测miR-4286的表达，可以对非小细胞肺癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。提出了miR-4286在制备抑制非小细胞肺癌肿瘤生长和转移药物中的作用。本专利技术在医学和生物制药领域有重大实际意义和巨大的应用价值。附图说明图1为NSCLC不同细胞株中miR-4286的表达水平；图2为组织芯片NSCLC组织中miR-4286的表达情况；图3为非小细胞肺癌组织中miR-4286的表达。具体实施方式以下结合附图对本专利技术进行进一步的说明。本具体实施方式仅仅是对本专利技术的解释，并不是对本专利技术的限制，本领域技术人员在阅读了本专利技术的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。现结合实施例和附图，对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施不仅限于此。实施例1miR-4286在非小细胞肺癌不同细胞株中的差异性表达采用Real-TimePCR方法检测NSCLC细胞株NCI-H1299（淋巴结转移）、肺鳞癌细胞SK-MES-1，NCI-H520和肺腺癌细胞GLC-82、A549、NCI-H460中miR-4286的表达水平。结果显示，miR-4286在来源于转移淋巴结细胞株NCI-H1299中的表达水平最高，鳞癌细胞SK-MES-1，NCI-H520次之，在NCI-H460、GLC-82、A549表达水平较低（图1）。实施例2采用原位杂交技术检测NSCLC组织芯片（芯片编号：HLugSqu150CS01、HLugA150CS02）中miR-4286的表达量。150例NSCLC患者样本来源于国家人类遗传资源共享服务平台（2005DKA21300），剔除信息不全及脱靶等因素，共入组患者140例，男105例，女35例；年龄35~72岁（60.25±9.22）岁；肿瘤直径≤3cm102例，＞3cm38例；腺癌72例，鳞癌68例；TNM分期：Ι期59例，II期45例，III期27例，IV期9例；淋巴结转移59例，未转移81例；远处转移9例，未转移131例；肿瘤分化程度：Ι期19例，II期84例，III期37例。所有患者均经临床确诊且术前未接受放、化疗，手术切除组织包含癌组织和相匹配的距离癌组织边缘5cm以上的远端正常组织。离体组织经常规4%甲醛固定并石蜡包埋，5μm厚度切片，制成直径1.5mm的组织芯片。采用原位杂交方法检测组织芯片中140例NSCLC癌组织及远端正常组织中miR-4286的表达，分析其表达水平与NSCLC临床病理特征的关系。按照丹麦Exiqon公司的原位杂交试剂盒miRCURYLNA™microRNAISHOptimizationKit（FFPE）（No.90008本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒含有miR-4286 的实时荧光定量PCR 引物，所述引物分别为：/nSEQ ID NO ：1上游引物序列：5'-GCGTCACCCCACTCCT-3'；/nSEQ ID NO ：2通用下游引物序列：5'-CGCTCACCCCACTCCT-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒含有miR-4286的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：
SEQIDNO：1上游引物序列：5'-GCGTCACCCCACTCCT-3'；
SEQIDNO：2通用下游引物序列：5'-CGCTCACCCCACTCCT-3'。


2.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂；所述试剂包括：组织总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、逆转录试剂和定量PCR试剂；
其中，逆转录试剂包括miR-4286的特异逆转录引物，其序列为：

【专利技术属性】
技术研发人员：马志红，陈莹蓉，李栋立，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33