一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针及高灵敏度检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针及高灵敏度检测方法，检测过程包括如下步骤：步骤一，提取人全血样本中的DNA；步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图：用MYD88 L265P F和MYD88 L265P WR引物及MYD88 L265P Probe探针特异性扩增野生DNA；用MYD88 L265P F和MYD88 L265P MR引物及MYD88 L265P Probe探针特异性扩增突变DNA；步骤三，利用荧光结果图判断突变结果；本发明专利技术利用AS‑PCR荧光法，再配合利用筛选得到的引物及探针，提高了检测的特异性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针及高灵敏度检测方法
本专利技术涉及基因突变检测领域，特别是一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针及高灵敏度检测方法。
技术介绍
髓系分化因子88(myeloiddifferentiationprimaryresponse88,MYD88)基因位于3号染色体短臂,共有5个外显子。MYD88L265P基因突变是MYD88基因位于第5个外显子38182640位点的T→C点突变,其导致了MYD88蛋白TIR区域的265位氨基酸-亮氨酸被脯氨酸所取代，是MYD88基因最主要的突变。MYD88基因突变见于约90％LPL/WM(淋巴浆细胞淋巴瘤/Waldenstrom巨球蛋白血症)。而SMZL(脾边缘区淋巴瘤)、CLL伴浆细胞分化及IgM分泌型MM中则罕见甚至无MYD88基因突变。故该基因突变可用于LPL/WM的鉴别诊断。另外MYD88基因突变也见于IgM-secretingMGUS(IgM型意义未明的单克隆免疫球蛋白血症)，突变率为60％-80％。同时研究表明，MYD88基因突变与预后存在相关性。与野生型相比，MYD88基因突变在LPL/WM患者中预示着疾病进展缓慢且生存期更长；而在IgM分泌型MGUS患者中则是危险因子，具有更高的血清IgM水平，更重的骨髓侵犯；发展为WM的风险增高。目前对于MYD88L265P突变检测常见有以下方法：1.PCR-Sanger测序法目前对基因突变检测最常见方法，多项研究均采用该方法检测MYD88突变。但是大部分LPL/WM患者，初诊时骨髓和外周血异常细胞比例低于30％，而常规Sanger测序法的灵敏度是15％-20％，常规的PCR-sanger法可能会出现假阴性测序结果。2.AS-PCR电泳法目前在类似单碱基突变的基因检测中也常用该检测方法。相较于传统的PCR-Sanger测序法，AS-PCR电泳法具有灵敏度更高、检测周期更短的优势。但是AS-PCR电泳法，采用电泳检测，在部分突变含量低的样本中，容易造成结果误判。市场需要一种快速、高灵敏、高特异检测MYD88L256P突变的检测方法，本专利技术解决这样的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针及高灵敏度检测方法，本专利技术利用AS-PCR荧光法，再配合利用筛选得到的引物及探针，提高了检测的特异性和灵敏度。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针，引物包括：MYD88L265PF:GGATGGCTGTTGTTAACC；MYD88L265PWR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA；MYD88L265PMR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG；探针包括：MYD88L265PProbe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM。一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，包括如下步骤：步骤一，提取人全血样本中的DNA；步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图：用MYD88L265PF和MYD88L265PWR1引物及MYD88L265PProbe探针特异性扩增野生DNA；用MYD88L265PF和MYD88L265PMR1引物及MYD88L265PProbe探针特异性扩增突变DNA；引物包括：MYD88L265PF:GGATGGCTGTTGTTAACC；MYD88L265PWR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA；MYD88L265PMR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG；探针包括：MYD88L265PProbe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM；步骤三，根据MYD88野生扩增体系和突变扩增体系扩增曲线图，判断结果是否突变；结果判读依据以下原则：注：MM代表突变扩增体系结果，MW代表野生扩增体系结果。前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，配置的PCR扩增体系包括：野生型体系，突变型体系；野生型体系包括：引物MYD88L265PF和MYD88L265PWR1各0.4-1ul，MYD88L265PProbe探针(10μM)0.2-0.6ul，PCRMasterMix12.5ul，去离子水4.9-10.5ul，DNA模版1-5ul；突变型体系包括：引物MYD88L265PF和MYD88L265PMR1各0.4-1ulul，MYD88L265PProbe探针(10μM)0.2-0.6ul，RealtimePCRMasterMix12.5ul，去离子水4.9-10.5ul，DNA模版1-5ul。前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，野生型体系包括：引物MYD88L265PF和MYD88L265PWR1各0.8ul，MYD88L265PProbe探针(10μM)0.4ul，PCRMasterMix12.5ul，去离子水8.5ul，DNA模版2ul；前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，突变型体系包括：引物MYD88L265PF和MYD88L265PMR1各0.8ul，MYD88L265PProbe探针(10μM)0.4ul，RealtimePCRMasterMix12.5ul，去离子水8.5ul，DNA模版2ul。前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图：PCR扩增的条件为:本专利技术的有益之处在于：本专利技术利用AS-PCR荧光法，再配合利用筛选得到的引物及探针，提高了检测的特异性，检测10例健康人血样，未扩增出阳性；提高了检测的灵敏度，经流式细胞仪检测，异常细胞含量低至2.6％的骨髓样本，仍可检出阳性。检测过程速度，只需要2-2.5小时即可完成检测。附图说明图1是使用测序方法对待检血液样本A进行MYD88L265P位点测序结果图；图2是使用本专利技术方法对待检血液样本A进行MYD88L265P位点检测结果图；图3是使用测序方法对待检血液样本B进行MYD88L265P位点测序结果图；图4是使用测序方法对待检血液样本A进行MYD88L265P位点检测结果图；图5是使用本专利技术的AS-PCR荧光方法对待检血液样本A进行MYD88基因L265P突变检测的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针，其特征在于，/n引物包括：/nMYD88 L265P F:GGATGGCTGTTGTTAACC；/nMYD88 L265P WR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA；/nMYD88 L265P MR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG；/n探针包括：/nMYD88 L265P Probe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针，其特征在于，
引物包括：
MYD88L265PF:GGATGGCTGTTGTTAACC；
MYD88L265PWR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA；
MYD88L265PMR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG；
探针包括：
MYD88L265PProbe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM。


2.一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，提取人全血样本中的DNA；
步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图：
用MYD88L265PF和MYD88L265PWR1引物及MYD88L265PProbe探针特异性扩增野生DNA；
用MYD88L265PF和MYD88L265PMR1引物及MYD88L265PProbe探针特异性扩增突变DNA；
引物包括：
MYD88L265PF:GGATGGCTGTTGTTAACC；
MYD88L265PWR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA；
MYD88L265PMR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG；
探针包括：
MYD88L265PProbe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM；
步骤三，根据MYD88野生扩增体系和突变扩增体系扩增曲线图，判断结果是否突变；
结果判读依据以下原则：



注：MM代表突变扩增体系结果，MW代表野生扩增体系结果。


3.根据权利要求2所述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，其特征在于，
配...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱良俊，
申请(专利权)人：杭州千麦医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33